甲亢易感性檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及甲亢易感性檢測(cè)方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]Graves'?。℅raves'disease,⑶），又稱(chēng)毒性彌漫性甲狀腺腫伴甲允，通常稱(chēng)為甲 亢，是一種甲狀腺激素（TH)分泌增多的、遺傳與環(huán)境共同起作用導(dǎo)致的器官特異性自身免 疫性疾病，是甲狀腺功能亢進(jìn)的最常見(jiàn)病因。甲亢臨床上的典型特征包括彌漫性甲狀腺腫、 甲狀腺功能亢進(jìn)的系列表現(xiàn)、眼癥以及脛前黏液水腫和指端粗厚。甲亢在臨床上目前為免 疫內(nèi)分泌主要疾病之一，甲亢所引起的心衰、甲狀腺危象的發(fā)生，常危及患者生命，致疾病 預(yù)后不良。最近的調(diào)查顯示中國(guó)人群的發(fā)病率為〇. 25~1. 09%,估計(jì)患者約有1300萬(wàn)。亞 洲人群的發(fā)病率較歐美和非洲人群發(fā)病率略
[0003] 同胞對(duì)研究顯示，同卵雙胞胎患甲允的一致率達(dá)36%,異卵雙胞胎患病 率為3%，甲亢發(fā)病的所有影響因素中遺傳的比重占79%〔Brix，T.H.，Kyvik，K. 0. ,Christensen,K. &Hegedus,L.Evidenceforamajorroleofheredityin Graves'disease:apopulation-basedstudyoftwoDanishtwincohorts.JClin EndocrinolMetab86, 930-4(2001)〕。遺傳因素在甲亢的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。
[0004] 甲亢的發(fā)病率存在著明顯的男女差異。好發(fā)于生育年齡的女性，女性發(fā)病率大約 是男性的5-10倍。在Turner綜合征患者中甲允的發(fā)病率很高，而Turner綜合征是由于X 染色體缺失或有其他異常導(dǎo)致的。研究也發(fā)現(xiàn)甲亢患者體內(nèi)X染色體失活偏移發(fā)生率顯著 高于同年齡段的健康個(gè)體。這些現(xiàn)象一致提示X染色對(duì)甲亢發(fā)病有重要的影響。
[0005] 近年來(lái)，單核苷酸變異（SNP)概念在多基因疾病研究中的廣泛運(yùn)用，同時(shí)，高通 量、低成本的SNP檢測(cè)手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)?？焖俜中吞峁┝丝赡?。這為在分子 水平上研究甲亢的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制開(kāi)辟了全新的思路和手段。SNP的存在與否以及等位 基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或 性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。另外，不同人群中SNP類(lèi)型和頻率存 在的這種差異也與不同人群對(duì)藥物及環(huán)境因素的反應(yīng)性不同密切相關(guān)。
[0006] 甲亢作為一種遺傳因素起較大作用的疾病，尋找易感基因基因進(jìn)而闡明其遺傳 機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。雖然已有許多關(guān)于遺傳變異與甲亢的研究，但沒(méi)有證實(shí) GPR174基因與甲亢相關(guān)性的報(bào)道，更沒(méi)有證實(shí)本發(fā)明所述的GPR174基因SNP與甲亢相關(guān)性 的報(bào)道。
[0007] 綜上所述，為了早期預(yù)防和診斷甲亢，本領(lǐng)域迫切需要尋找甲亢易感基因，并開(kāi)發(fā) 用于甲亢疾病預(yù)警的方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人運(yùn)用Plink軟件對(duì)X染色體的數(shù)據(jù)同常染色一樣進(jìn)行常規(guī)的Cochran Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)X染色體上的易感基因。鑒于Plink軟件常規(guī)Cochran Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)的方法對(duì)X染色體分析的缺陷，本發(fā)明人進(jìn)一步用另外的兩種方法(男 女分層分析和Clayton的方法)對(duì)X染色體進(jìn)行分析。兩種關(guān)聯(lián)分析的方法都顯示一組存在 著強(qiáng)LD關(guān)系的SNPs與⑶相關(guān)。這些關(guān)聯(lián)的SNPs位于Xq21. 1區(qū)域，分布在GPR174基因及 其周?chē)鷧^(qū)域。P值最低的SNP是距離GPR174基因約155-kb的rs5912838(P1()gisti。_essim= 4. 60Xl(T8;PsnpMataix=L36Xl〇-9;OR=L80, 95%CI1. 48-2. 18)。推定填補(bǔ)分析并沒(méi)有在Xq21. 1 區(qū)域發(fā)現(xiàn)P值更低的SNPs。在這些關(guān)聯(lián)的SNPs當(dāng)中，rs3827440是一個(gè)導(dǎo)致GPR174發(fā)生 非同義突變的SNP，它與P值最低的rs3827440之間存在著強(qiáng)的LD關(guān)系。雖然rs3827440 不是這一區(qū)域P值最低的SNP，但是它是非常值得研究的功能變異。
[0009] 在驗(yàn)證階段的4, 564例患者和3, 968例性別匹配的對(duì)照中，對(duì)rs3827440進(jìn)行分 型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果驗(yàn)證了最初的關(guān)聯(lián)，并且合并分析的P值達(dá)到了全基因組關(guān)聯(lián)研究的顯著性 水平（combinedPlogisticregression=5. 53X1CT21;combinedPsnpMatrix=4. 26X1CT22; 0R=1. 69, 95%C IL53-L86;表 3-6)。rs3827440 的OR值為 1.69 (95%C11.53-1.86)，在本發(fā)明的研究樣 本中僅低于HLA區(qū)域的rs4947296。提示在中國(guó)人群中GPR174是一個(gè)重要的易感基因。
[0010]RS3827440是GPR174基因編碼區(qū)的第519位C-T變異，造成第162位氨基酸由 脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸（P162S)。本發(fā)明的重測(cè)序結(jié)果顯示5'非翻譯區(qū)（5'UTR)區(qū)域的兩個(gè) SNPs(rs3810711與rs3810712)與rs3827440是完全連鎖不平衡關(guān)系。RT-PCR結(jié)果顯示 rs3827440的基因型與外周血GPR174的表達(dá)量相關(guān)。無(wú)論男性群體還是女性群體，TT或T 基因型都與GPR174的高表達(dá)相關(guān)(分別為P=0. 009和P=0. 029)。在男女混合人群中，攜帶 TT或T的群體GPR174的表達(dá)量顯著高于攜帶CC或C的群體（P=0.002)。這些結(jié)果提示， rs3827440或者其他兩個(gè)與之連鎖的5'UTR區(qū)域SNPs(rs3810711與rs3810712)單獨(dú)或 者共同影響了GPR174基因的表達(dá)量，從而影響了GD的遺傳易感性。
[0011] 因此，本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷（尤其是早期診斷）甲亢的方法及檢 測(cè)試劑盒。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療甲亢的方法。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的甲亢易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括 步驟：
[0014] 檢測(cè)該個(gè)體的GPR174基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的GPR174基因、轉(zhuǎn)錄本 和/或蛋白相比較，
[0015] 存在差異就表明該個(gè)體患甲亢的可能性高于正常人群。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測(cè)的是GPR174的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常 GPR174核苷酸序列比較差異。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性：
[0018] 367 位C-T;
[0019] 其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQID N0:1。
[0020] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在G蛋白偶聯(lián)受體174 (GPR174)的單核苷酸多態(tài)變異的方法，包括步驟：
[0021] (a)用GPR174基因特異性引物擴(kuò)增樣品的GPR174基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0022]和
[0023] (b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：
[0024] 367 位C-T;
[0025] 其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO: 1。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQID N0:2和3的序列。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100_2000bp、優(yōu)選為150_1500bp、更 佳地為200-1000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位。
[0028] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于輔助診斷甲亢或檢測(cè)甲亢易感性甲亢的試 劑盒，它包括特異性擴(kuò)增GPR174基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 100-2000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑：
[0030] (a)與SEQIDNO: 1中第367位的突變結(jié)合的探針；
[0031] (b)識(shí)別SEQIDNO: 1中第367位的突變的限制性?xún)?nèi)切酶。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性：
[0033] 367 位C-T;
[0034] 其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQID N0:1。
[0035] 本發(fā)明還涉及能特異性擴(kuò)增GPR174基因或轉(zhuǎn)錄本、且所擴(kuò)增的產(chǎn)物含有SEQID NO:1的第367位的引物在制備用于輔助診斷甲亢或檢測(cè)甲亢易感性的試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物長(zhǎng)度為100_2000bp，優(yōu)選為 150-1500bp，更佳地為 200-1000bp，更佳為 200-800bp。
[0037] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒還含有：
[0038] (a)與SEQIDNO: 1中第367位的突變結(jié)合的探針；
[0039] (b)識(shí)別SEQIDNO: 1中第367位的突變的限制性?xún)?nèi)切酶。
[0040] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性：
[0041] 367 位C-T;
[0042] 其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQID N0:1。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，對(duì)遍布X染色體上大量SNPs進(jìn)行了測(cè)定和分 析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了GPR174的基因組序列與甲亢密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在 GPR174的SEQIDNO: 1中第367位的SNP(367位C-T)(記為RS3827440)在對(duì)照組和病 例組中的分布存在顯著性差異（P〈〇. 05)，因此可作為輔助性檢測(cè)甲亢（或其易感性）的特 異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0044]G蛋白偶聯(lián)受體 174(Gprotein-coupledreceptorl74,GPR174)基因位于染色 體Xq21. 1區(qū)域，由一個(gè)編碼333個(gè)氨基酸的外顯子組成，這個(gè)基因?qū)儆贕PCR超家族，被歸 為GPCR1類(lèi)基因家族。GPCR超家族是跨膜蛋白，共同特點(diǎn)是有7個(gè)a-螺旋的跨膜區(qū)，在細(xì) 胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。至今已發(fā)現(xiàn)超過(guò)50%的藥物的作用靶點(diǎn)都是GPCRs。最近，有研 究發(fā)現(xiàn)LysoPS是GPR174的配體。在體內(nèi)，LysoPS是由免疫系統(tǒng)分泌，作為一個(gè)脂類(lèi)介質(zhì) 調(diào)控體內(nèi)免疫進(jìn)程。LysoPS與GPR174結(jié)合后可以刺激細(xì)胞外cAMP濃度的增加，并且這種 刺激作用是劑量依賴(lài)的。研究也發(fā)現(xiàn)，引起cAMP水平增高或者cAMP的類(lèi)似物都會(huì)阻止體 內(nèi)Thl類(lèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但是Th2因子的產(chǎn)生不受影響，甚至提高。通常認(rèn)為⑶是一種 以Th2類(lèi)反應(yīng)為主導(dǎo)的疾病。因此，cAMP水平增高導(dǎo)致的Th2類(lèi)反應(yīng)占主導(dǎo)有可能參與了 ⑶的病理過(guò)程。
[0045] 我們的研究顯示易感等位基因?qū)е翯PR174基因表達(dá)水平的提高，而GPR174基因 表達(dá)水平的提高有可能導(dǎo)致胞外cAMP濃度的增高。我們的表達(dá)譜結(jié)果分析顯示GPR174基 因廣泛的表達(dá)于免疫相關(guān)的組織，并且在甲狀腺中也有一定量的表達(dá)。這種表達(dá)模式提示 GPR174基因可能參與免疫過(guò)程，并且與甲狀腺的結(jié)構(gòu)或者功能有一定的聯(lián)系，有可能在GD 的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。
[0046] 本發(fā)明人通過(guò)對(duì)分布于整條X染色體的SNPs在中國(guó)人群中進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn) GPR174基因上的rs3827440(SEQIDN0:1中367位C-T)與甲亢的易感性相關(guān)。rs3827440 是GPR174基因編碼區(qū)的第519位C-T變異，造成第162位氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸 (P162S)。另外對(duì)GPR174基因中的整個(gè)外顯子區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了許多頻率較低的SNP 也與甲亢易感性相關(guān)。以rs3827440對(duì)甲亢的遺傳貢獻(xiàn)率最大。
[0047] 具體而言，本發(fā)明揭示了GPR17