本發(fā)明涉及一種癌胚抗原(CEA)濃度的檢測(cè)方法，尤其涉及一種CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒三層夾心式結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及其用于CEA濃度的檢測(cè)方法；屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物。97％的健康成人血清CEA濃度在2.5g/L以下，原發(fā)性結(jié)腸癌患者CEA增高占45～80％。除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，胰腺癌、膽管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在50～70％。因此該指標(biāo)檢測(cè)對(duì)于診斷某些疾病具有較大意義。

傳統(tǒng)的測(cè)定CEA的方法有熒光免疫分析、放射免疫法，酶聯(lián)免疫檢測(cè)法等。這些檢測(cè)方法雖然在一定程度上靈敏有效，但對(duì)技術(shù)要求高，耗時(shí)耗力，且對(duì)儀器有一定的要求，各自具有一定的局限性。相比以上方法，電化學(xué)檢測(cè)法具有儀器簡(jiǎn)單、操作方便以及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有的檢測(cè)CEA方法存在的不足，本發(fā)明的目的是在于提供一種選擇性好、靈敏度高、檢測(cè)限低、檢測(cè)范圍寬的檢測(cè)CEA濃度的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種CEA濃度的檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：

1)在金納米棒載體上修飾CEA適配體，得到CEA適配體/金納米棒復(fù)合物；

2)將CEA抗體修飾到氧化石墨烯表面后，將所述氧化石墨烯固定到電極表面，再采用牛血清白蛋白對(duì)所述電極表面進(jìn)行封閉，得到CEA抗體修飾電極；

3)取一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)CEA溶液分別滴加至所述CEA抗體修飾電極的表面進(jìn)行CEA與CEA抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，得到一系列CEA抗體—CEA修飾電極；

4)將所述CEA適配體/金納米棒復(fù)合物滴加至各CEA抗體—CEA修飾電極表面進(jìn)行CEA與CEA適配體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，得到一系列含CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)的電極；

5)向各含CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)的電極表面分別滴加鉬酸鈉溶液進(jìn)行反應(yīng)后，采用方波伏安法進(jìn)行測(cè)定，得到一系列方波伏安曲線；

6)將各方波伏安曲線中的峰電流值與對(duì)應(yīng)的CEA濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；

7)取待測(cè)CEA溶液替換標(biāo)準(zhǔn)CEA溶液按3)、4)和5)的步驟進(jìn)行操作，得到相應(yīng)峰電流值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得待測(cè)CEA溶液的濃度。

優(yōu)選的方案，在金納米棒載體溶液中加入含末端巰基修飾的CEA適配體的溶液，在室溫下反應(yīng)，即得CEA適配體/金納米棒復(fù)合物。

較優(yōu)選的方案，所述金納米棒載體通過如下方法制備得到：先采用NaBH₄還原HAuCl₄，得到納米金種子溶液，所述納米金種子溶液加入到含十六烷基三甲基溴化銨、HAuCl₄、AgNO₃和抗壞血酸的溶液中反應(yīng)，得到金納米棒載體。更優(yōu)選的方案，含十六烷基三甲基溴化銨、HAuCl₄、AgNO₃和抗壞血酸的溶液由45～55mL濃度為0.05～0.15M的十六烷基三甲基溴化銨溶液，0.8～1.4mL質(zhì)量百分比濃度為0.5～1.5％的HAuCl₄溶液，0.2～0.6mL濃度為5～15mM的AgNO₃溶液和0.25～0.35mL濃度為0.05～0.15M的抗壞血酸組成。

優(yōu)選的方案，氧化石墨烯溶液采用(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和N-N-羥基琥珀酰亞胺溶液活化后，與CEA抗體進(jìn)行反應(yīng)，得到CEA抗體修飾氧化石墨烯，所述CEA抗體修飾氧化石墨烯滴加到電極表面，得到CEA抗體修飾電極。

優(yōu)選的方案，將濃度分別為1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL和10ng/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)CEA溶液分別滴加到CEA抗體修飾電極的表面，進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)。

較優(yōu)選的方案，所述特異性結(jié)合反應(yīng)的條件為：溫度為36～37℃，時(shí)間為1～2h。

優(yōu)選的方案，步驟4)中的特異性結(jié)合反應(yīng)的條件為：溫度為36～37℃，時(shí)間為1～2h。

優(yōu)選的方案，所述鉬酸鈉溶液的濃度為1～5mmol/L。

優(yōu)選的方案，所述方波伏安法的測(cè)定條件為：以0.3～0.7mol/L的硫酸溶液為電解液，在0～0.5V電壓范圍內(nèi)，頻率為10～20Hz。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，含CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)與鉬酸鈉溶液反應(yīng)生成磷鉬酸鹽沉淀。CEA適配體上的磷酸根與鉬酸鈉反應(yīng)生成電化學(xué)活性的磷鉬酸鈉鹽沉淀，產(chǎn)生氧化還原電流通過方波伏安法進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，在金納米棒載體溶液中加入末端巰基修飾的適配體，在25～37℃溫度下反應(yīng)2～3h，即得CEA適配體/金納米棒復(fù)合物。巰基的作用是通過巰基和金之間的共價(jià)鍵作用將CEA適配體固定到金納米棒載體上。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，末端修飾巰基的CEA適配體序列為SH-ATACCAGC TTATTCAATT?？芍苯淤?gòu)買于上海生工生物工程有限公司。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，氧化石墨烯溶液與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-N-羥基琥珀酰亞胺溶液在25～37℃混合反應(yīng)1～3h，將石墨烯表面活化，將活化石墨烯分離，與CEA抗體反應(yīng)，即得CEA抗體修飾氧化石墨烯。將CEA抗體修飾氧化石墨烯直接滴加到電極表面得到CEA抗體修飾電極。其中，CEA抗體與活化石墨烯的反應(yīng)比例為以濃度為10μg/mL的CEA抗體溶液與濃度為1mg/mL的活化石墨烯溶液反應(yīng)，反應(yīng)得到CEA抗體修飾氧化石墨烯，將CEA抗體修飾氧化石墨烯分離，洗滌2次。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述金納米棒載體通過如下方法制備得到：首先通過NaBH₄還原HAuCl₄得到納米金種子溶液；往50mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化銨溶液中加入1.1mL HAuCl₄(1％w/w)，0.4mL AgNO₃(10mM)和0.29mL抗壞血酸(0.1M)，得到混合溶液；往上述混合溶液中加入合成的納米金種子溶液，持續(xù)反應(yīng)24小時(shí)，即得到金納米棒載體。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，將CEA抗體修飾石墨烯溶液直接滴加在電極表面，得到CEA抗體修飾電極；CEA抗體修飾石墨烯溶液的體積為3～8μL，濃度為0.5～1.5mg/mL。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，采用的電極為玻碳電極。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟5)中的反應(yīng)條件為：在36～38℃溫度下反應(yīng)15～25min。

本發(fā)明的檢測(cè)CEA濃度的方法是基于構(gòu)建的CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，該三層夾心式結(jié)構(gòu)用于檢測(cè)CEA濃度，具有選擇性好、靈敏度高、檢測(cè)限低，且檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案，首先進(jìn)行金納米棒載體的合成，將帶巰基的CEA適配體結(jié)合到金納米棒載體表面；將CEA抗體修飾氧化石墨烯固定到電極表面，用牛血清白蛋白對(duì)電極表面進(jìn)行封閉，防止在電極表面發(fā)生非特異性吸附；然后在電極表面滴加CEA進(jìn)行反應(yīng)，電極上抗體能與CEA進(jìn)行特異性識(shí)別并結(jié)合；往電極上加入CEA適配體/金納米棒復(fù)合物，被抗體捕獲的CEA能與金納米棒上的適配體發(fā)生特異性結(jié)合；在電極上滴加鉬酸鈉反應(yīng)生成磷鉬酸鈉鹽沉淀；以0.5mol/L的硫酸溶液為電解液，在0-0.5V電壓范圍內(nèi)，進(jìn)行測(cè)定方波伏安曲線，曲線峰電流與CEA濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)CEA溶液濃度的檢測(cè)。而在傳統(tǒng)的適配體傳感器中，需要在適配體上修飾信號(hào)分子，實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)。而在本發(fā)明中采用適配體同時(shí)作為CEA捕獲分子和信號(hào)分子，簡(jiǎn)化了傳感器制備和檢測(cè)步驟。通過加入不同濃度CEA經(jīng)電化學(xué)測(cè)量處理后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條直線(如圖4)，CEA濃度越大電流值越大；再加入未知濃度CEA測(cè)得電流值，將該電流值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較得到未知濃度CEA的濃度。本發(fā)明的技術(shù)方案利用金納米棒納米粒子大的比表面積，能結(jié)合大量適配體分子，促進(jìn)信號(hào)放大，增強(qiáng)了靈敏度，降低了檢測(cè)限。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明的技術(shù)方案以金納米棒為載體構(gòu)建CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)，金納米棒大的比表面積增加了適配體負(fù)載量，且與CEA之間通過特異性結(jié)合，促進(jìn)信號(hào)放大，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度，降低檢測(cè)限，檢測(cè)范圍廣。

(2)本發(fā)明的技術(shù)方案可測(cè)濃度為0.1pg/mL～10ng/mL的CEA，而人類正常血清中CEA的濃度為2.5ng/mL，當(dāng)患相關(guān)腫瘤時(shí)，CEA濃度可異常增高。因此，通過本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)經(jīng)過稀釋后患者血清具有足夠的檢測(cè)靈敏度。

(3)本發(fā)明同時(shí)采用CEA適配體作為捕獲分子和信號(hào)分子，大大簡(jiǎn)化了CEA適配體傳感器制備和檢測(cè)步驟。本發(fā)明技術(shù)基于CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒復(fù)合物三層夾心式結(jié)構(gòu)檢測(cè)CEA的方法檢測(cè)范圍寬，無需借助精密儀器設(shè)備，并且可推廣至其他傳感器，用于對(duì)不同蛋白或小分子的濃度進(jìn)行檢測(cè)。

附圖說明

【圖1】為本發(fā)明的檢測(cè)方法的原理示意圖；

【圖2】為金納米棒載體的TEM示圖；

【圖3】A為實(shí)施例1中CEA適配體修飾電極與鉬酸鈉反應(yīng)后的循環(huán)伏安圖，B為電極檢測(cè)空白和10ng/mLCEA的方波伏安圖；

【圖4】為實(shí)施例1中不同濃度CEA對(duì)應(yīng)的方波伏安曲線以及測(cè)的CEA的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實(shí)施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場(chǎng)購(gòu)買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

實(shí)施例1

本發(fā)明CEA的檢測(cè)方法的一種實(shí)施例，其原理示意圖如圖1所示。該檢測(cè)方法具體包括以下步驟：

(1)金納米棒載體的合成：首先通過過量NaBH₄在30℃還原濃度為1～2％的HAuCl₄溶液得到納米金種子溶液。然后，往50mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化銨溶液中加入1.1mL HAuCl₄(1％w/w)，0.4mL AgNO₃(10mM)和0.29mL抗壞血酸(0.1M)。最后往上述溶液中加入0.06mL合成的納米金種子溶液?；旌先芤撼掷m(xù)反應(yīng)24小時(shí)即得到金納米棒載體。

(2)對(duì)金納米棒載體修飾CEA適配體：將合成的金納米棒載體分散在10 M CEA適配體溶液中室溫下反應(yīng)2h，離心洗滌去掉未反應(yīng)的CEA適配體，得到CEA適配體/金納米棒復(fù)合物。

(3)在電極表面固定CEA抗體：先將氧化石墨烯溶液(濃度為1～2mg/mL)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-N-羥基琥珀酰亞胺溶液(濃度為50～100mM)在25～37℃混合反應(yīng)2h，石墨烯分離后，再將CEA抗體與反應(yīng)后的氧化石墨烯溶液反應(yīng)，即得CEA抗體修飾氧化石墨烯。將5LCEA抗體修飾氧化石墨烯直接滴加到玻碳電極表面得到CEA抗體修飾電極。

(4)不同濃度CEA特異性結(jié)合：將濃度為1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL和10ng/mL的人CEA溶液分別加到CEA抗體修飾電極表面，37℃水浴反應(yīng)1h，緩沖溶液沖洗電極表面3次除去未結(jié)合上的CEA，得到結(jié)合了不同濃度CEA的CEA抗體—CEA修飾電極。

(5)CEA與金納米棒載體特異性結(jié)合：將5μLCEA適配體/金納米棒復(fù)合物滴加到CEA抗體—CEA修飾電極表面，在37℃水浴條件下反應(yīng)1h，用緩沖溶液沖洗電極表面3次，除去未反應(yīng)掉的金納米棒復(fù)合物，得到CEA抗體—CEA—EA適配體/金納米棒三層夾心式結(jié)構(gòu)。

(6)CEA適配體與鉬酸鈉反應(yīng)：向形成三層夾心式結(jié)構(gòu)的電極表面滴加1mM鉬酸鈉溶液25℃反應(yīng)20min。

(7)方波伏安法檢測(cè)：以0.5mol/L的硫酸溶液為電解液，在0-0.5V電壓范圍內(nèi)，以15Hz的頻率進(jìn)行測(cè)定，得到各電極的峰電流值，然后將各電極的峰電流值與對(duì)應(yīng)的CEA濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到測(cè)量CEA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(8)實(shí)際樣品的測(cè)量：取5pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、10ng/mLCEA的血清溶液，滴加到修飾有CEA抗體的電極表面，反應(yīng)完沖洗電極后，然后將5μLCEA適配體/金納米棒復(fù)合物滴加到電極表面，在37℃水浴條件下反應(yīng)1h，用緩沖溶液沖洗電極表面3次除去未結(jié)合上的CEA，得到含CEA抗體—CEA—CEA適配體/金納米棒三層夾心式結(jié)構(gòu)的電極，在該電極表面滴加1mM鉬酸鈉溶液25℃反應(yīng)20min，用方波伏安法測(cè)峰電流值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)得到測(cè)量濃度值，測(cè)量濃度值與ELISA結(jié)果相比有很好的一致性，相關(guān)系數(shù)為0.993。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。