本發(fā)明涉及微液滴生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)方法及其系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

液滴微流控技術(shù)是微流控芯技術(shù)的一個(gè)重要的組成部分，其特征是在微流道或毛細(xì)管中將兩種不相容的流體形成微米尺度的液滴。生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域中最常見的是“油包水”的液滴。其中，油作為將每個(gè)液滴相互隔離的載體。這種微米尺度的液滴也被作為微反應(yīng)器。也就是說，一個(gè)直徑幾十微米的液滴可以看成是一個(gè)傳統(tǒng)生化檢測(cè)中使用的試管，同樣可以在微液滴內(nèi)進(jìn)行生化反應(yīng)和用于生物醫(yī)學(xué)中目標(biāo)分子的檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)的試管，微液滴反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)包括：(1)微液滴的體積只有皮升級(jí)，相當(dāng)于反應(yīng)體積縮小了6個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，微液滴反應(yīng)所需的試劑量大大減少，反應(yīng)成本大幅降低；(2)一次反應(yīng)中使用的微液滴數(shù)量可以高達(dá)上千萬個(gè)，這使得檢測(cè)通量能夠得到極大的提高；(3)由于微液滴體積小，其背景噪聲也相應(yīng)的得到了很大程度的降低，使得檢測(cè)靈敏度能有很大的提升。因此，微液滴技術(shù)是一項(xiàng)很有前景的生化分析檢測(cè)技術(shù)。

基于微液滴的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種基于單分子PCR方法來對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)精確定量的方法。其原理是將大量稀釋后的核酸溶液分散至微液滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)只有0個(gè)和1個(gè)兩種情況。經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)定量PCR不同，數(shù)字PCR通過直接計(jì)數(shù)的方法，可以實(shí)現(xiàn)起始核酸模板的絕對(duì)定量。

在傳統(tǒng)的多指標(biāo)檢測(cè)當(dāng)中，每一個(gè)反應(yīng)試管里進(jìn)行一種特定反應(yīng)。因而需要對(duì)每一個(gè)試管貼上特定的標(biāo)簽，以標(biāo)識(shí)其管內(nèi)的反應(yīng)物。同理，一個(gè)微液滴就相當(dāng)于一個(gè)反應(yīng)試管，那么在多指標(biāo)檢測(cè)當(dāng)中，也需要特殊的“標(biāo)簽”來識(shí)別和區(qū)分每一個(gè)微液滴內(nèi)的反應(yīng)物。給微液滴反應(yīng)貼“標(biāo)簽”的技術(shù)，叫做微液滴的編碼技術(shù)。高通量多指標(biāo)檢測(cè)對(duì)微液滴的編碼技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。目前常用的微液滴編碼方法包括以下三種：

(1)基于顏色信息的微液滴編碼方法。通過在不同的微液滴中加入不同顏色的染料，并通過檢測(cè)其顏色信息來實(shí)現(xiàn)解碼?；陬伾畔⒌奈⒁旱尉幋a方法具有編碼直觀和無需復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，但是基于顏色信息的編碼方法存在編碼容量不高、編碼染料影響生化反應(yīng)效率等不足。

(2)基于空間位置信息的微液滴編碼方法。在已知空間位置的微結(jié)構(gòu)加入已編號(hào)的生化反應(yīng)信息的液滴，并通過檢測(cè)其空間位置信息來實(shí)現(xiàn)解碼。空間位置信息編碼的方法具有解碼方便、解碼速度快等優(yōu)點(diǎn)。但受到加工工藝和空間體積限制等因素限制，使其編碼的容量容易受到限制。同時(shí)，在液滴加樣環(huán)節(jié)，也存在一定的挑戰(zhàn)，對(duì)加工工藝和檢測(cè)設(shè)備都提出了更高的要求。

(3)基于核酸序列的微液滴編碼方法。在不同種類的微液滴內(nèi)加入不同已知的特定核酸序列，并通過對(duì)核酸序列的測(cè)序來完成微液滴的解碼?；诤怂嵝蛄械木幋a方法具有很高的編碼容量，但是由于核酸序列測(cè)序需要比較復(fù)雜的過程，因而這種編碼方式只適合一些特定的場(chǎng)合。

由于現(xiàn)有方法編碼能力的限制，目前多指標(biāo)的數(shù)字PCR只能實(shí)現(xiàn)數(shù)個(gè)到十?dāng)?shù)個(gè)的不同位點(diǎn)的同步檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服前面所說的幾種微液滴編碼方法的不足，提出一種基于標(biāo)志液滴的時(shí)序編碼方法。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：不同的試劑按順序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后順序排成一個(gè)隊(duì)列；帶有標(biāo)記信息的微液滴成為標(biāo)志液滴，其所在隊(duì)列中的區(qū)域成為編碼區(qū)；帶有生化反應(yīng)試劑的微液滴成為功能液滴，其所在隊(duì)列中的區(qū)域稱為功能區(qū)；每個(gè)功能區(qū)之間都間隔著一個(gè)編碼區(qū)，由這種反應(yīng)區(qū)加編碼區(qū)的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成了完整的編碼隊(duì)列；和當(dāng)編碼隊(duì)列進(jìn)入檢測(cè)區(qū)時(shí)，根據(jù)進(jìn)樣的先后順序以及各個(gè)編碼區(qū)信息，解碼每個(gè)功能區(qū)內(nèi)包含的功能液滴所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)物。

在一種實(shí)施方式中，通過控制外部各個(gè)進(jìn)樣器例如注射器的工作順序，實(shí)現(xiàn)不同的試劑按順序在微流控芯片管道中生成微液滴。

在一種實(shí)施方式中，進(jìn)樣器通過配件例如特氟龍卡具與芯片入口相連。

在一種實(shí)施方式中，包括二個(gè)裝載礦物油用于后續(xù)液滴生成的注射器，一個(gè)裝載標(biāo)志溶液用于生成標(biāo)志液滴的注射器；和多個(gè)裝載生化反應(yīng)試劑用于生成功能液滴的注射器。

在一種實(shí)施方式中，標(biāo)志溶液和各個(gè)生化反應(yīng)試劑按照進(jìn)樣順序在微流控芯片內(nèi)“十字”液滴生成區(qū)域與礦物油匯合，形成“油包水”的液滴。

在一種實(shí)施方式中，在編碼時(shí)通過控制標(biāo)志液滴的熒光強(qiáng)度，使得標(biāo)志液滴與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，在編碼時(shí)通過控制標(biāo)志液滴體積的不同，從而控制熒光信號(hào)持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短，使標(biāo)志液滴與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，通過控制標(biāo)志液滴的顏色，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，通過控制標(biāo)志液滴的吸光度的變化，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，通過控制標(biāo)志液滴的反射角度的變化，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，標(biāo)志液滴自身內(nèi)部的排列組合產(chǎn)生特定順序和意義，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實(shí)施方式中，提供一種在本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)方法中應(yīng)用的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括進(jìn)樣區(qū)、液滴生成區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)。

本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)方法及其系統(tǒng)具有以下四個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明具有編碼容量大，編碼容量不受編碼方法限制的優(yōu)點(diǎn)。

普通的液滴編碼方法，比如顏色和熒光強(qiáng)度編碼方法，編碼容量會(huì)受到檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于編碼特征的分辨能力的限制，比如對(duì)顏色差別或熒光強(qiáng)度差別的分辨能力限制，而存在編碼能力的上限，限制了微液滴的實(shí)際應(yīng)用。而本發(fā)明提供的編碼方法，不受系統(tǒng)對(duì)編碼特征的分辨能力的限制，理論上不存在編碼容量的上限，這將使得微液滴的多指標(biāo)分析能力大大增強(qiáng)。

(2)本發(fā)明提供的編碼方法，具有編碼物質(zhì)和生化反應(yīng)在空間上完全隔離的優(yōu)點(diǎn)。這使得編碼物質(zhì)不會(huì)對(duì)生化反應(yīng)產(chǎn)生任何的影響，這對(duì)保證高靈敏度的生化檢測(cè)反應(yīng)能夠正常進(jìn)行尤為重要。

(3)本發(fā)明提供的編碼還具有易于解碼和解碼魯棒性高的優(yōu)點(diǎn)。

由于液滴隊(duì)列中標(biāo)志液滴和功能液滴在空間上不互相混合，因而不需要同時(shí)解碼編碼信息和讀取生化反應(yīng)的信息，降低對(duì)系統(tǒng)讀取和處理信息能力的要求。同時(shí)，由于液滴隊(duì)列中各個(gè)功能區(qū)是相互分隔的，也就是含有不同的生化反應(yīng)的液滴是被編碼區(qū)所隔離，解碼的時(shí)候就不容易發(fā)生對(duì)生化反應(yīng)類別判讀錯(cuò)誤的情況，從而實(shí)現(xiàn)高的解碼魯棒性。

(4)本發(fā)明提供的編碼方法還具有易于集成芯片實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)點(diǎn)。

由于編碼方法要求液滴保持隊(duì)列的形式，因此整個(gè)過程都是要求在封閉的管道內(nèi)的，適合集成芯片實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn)。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1是本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)方法示意圖；

圖2是本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)系統(tǒng)示意圖；

圖3是高熒光強(qiáng)度作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)中經(jīng)過PCR反應(yīng)后的陽性液滴與陰性液滴的熒光信號(hào)；

圖4是高熒光強(qiáng)度作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)中含有量子點(diǎn)的標(biāo)志液滴的熒光信號(hào)；

圖5是具有高熒光強(qiáng)度為特征的標(biāo)志液滴的編碼原理示意圖；

圖6是以不同體積作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖7是以不同顏色作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖8是以不同吸光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖9是以不同反光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖；和

圖10是具有多種特征的標(biāo)志液滴的編碼方法示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)實(shí)施例中的附圖，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。以下實(shí)施例中所提到的方位用語，例如：上、下、左、右、前、后等，僅是參考附圖的方向；因此使用的方位用語是用來說明并非限制本發(fā)明?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本申請(qǐng)保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼原理

如圖1所示，通過控制外部各個(gè)注射泵的工作順序，來實(shí)現(xiàn)不同的試劑按特定的順序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照這樣的先后順序排成一個(gè)隊(duì)列。帶有標(biāo)記信息的微液滴成為標(biāo)志液滴，其所在隊(duì)列中的區(qū)域成為編碼區(qū)；帶有生化反應(yīng)試劑的微液滴成為功能液滴，其所在隊(duì)列中的區(qū)域稱為功能區(qū)，每個(gè)功能區(qū)之間都間隔著一個(gè)編碼區(qū)。由這種反應(yīng)區(qū)加編碼區(qū)的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成了完整的編碼“隊(duì)列”。當(dāng)編碼“隊(duì)列”進(jìn)入檢測(cè)區(qū)時(shí)，根據(jù)進(jìn)樣的先后順序以及各個(gè)編碼區(qū)信息，能夠解碼每個(gè)功能區(qū)內(nèi)的包含的功能液滴所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)物。

實(shí)施例二本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)系統(tǒng)

圖2為本發(fā)明的微液滴反應(yīng)編碼檢測(cè)系統(tǒng)示意圖，該系統(tǒng)分為四個(gè)區(qū)域：進(jìn)樣區(qū)、液滴生成區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)。A1,A2……An是對(duì)應(yīng)著不同的進(jìn)樣口，用注射泵進(jìn)行進(jìn)樣。A1是用于生成標(biāo)志液滴的進(jìn)樣口，A2，A3……An是用于生成功能液滴的進(jìn)樣口，在整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行工作時(shí)，進(jìn)樣的順序是A1-A2-A1-A3-A1……即在進(jìn)樣時(shí)用標(biāo)志液滴將功能液滴分隔開。在通過B1，B2相連的交叉點(diǎn)(即液滴生成區(qū))，通過油包水的方式生成液滴后，按照一定的先后順序在反應(yīng)區(qū)內(nèi)排布并發(fā)生一定的生化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在C口的檢測(cè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，每一次檢測(cè)到與功能液滴不同的標(biāo)志液滴時(shí)，便可獲知上一功能液滴即將結(jié)束，下一功能液滴即將開始通過檢測(cè)通道。

實(shí)施例三以高熒光強(qiáng)度作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)

步驟1液體試劑進(jìn)樣控制

本發(fā)明提出的編碼方法，需要液滴在管道中形成編碼區(qū)和功能區(qū)交錯(cuò)的“隊(duì)列”，因此對(duì)不同試劑進(jìn)樣的順序有一定的要求，而進(jìn)樣的順序通過控制外部的注射泵的工作順序來決定。

圖2所示的的注射泵采用高精度的注射泵(Harvard Apparatus，PHD Ultra)，每個(gè)注射泵上固定有一個(gè)1ml的注射器，并通過特氟龍管與芯片入口相連。每個(gè)注射器內(nèi)裝載有不同的試劑，其中B1和B2對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)裝載的是礦物油，用于后續(xù)液滴生成；A1對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)裝載的是濃度為1的M，熒光波長(zhǎng)是525nm的水溶性CdSe量子點(diǎn)溶液，用于生成標(biāo)志液滴；A2，A3，A4對(duì)應(yīng)的注射器都裝載了包含50μL的Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes，25μL含有20ng基因組DNA的溶液和25μL引物，其中A2、A3和A4包含的引物分別為GJB2基因、MTRNR1基因和MYO7a基因的上下游引物。A2、A3和A4中的溶液用于形成不同的功能液滴。通過控制注射泵的工作，不同試劑按以下順序進(jìn)樣，A1、A2、A1、A3、A1、A4、A1，每次試劑進(jìn)樣速度為400μL/h，進(jìn)樣時(shí)間30秒，其中B1和B2是全程持續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)樣速度為400μL/h。

步驟2液滴生成

進(jìn)樣試劑會(huì)按照進(jìn)樣順序在芯片內(nèi)“十字”液滴生成區(qū)域與B1和B2中的礦物油匯合，形成“油包水”的液滴?！笆帧眳^(qū)域管道深50μm，寬為50μm，按前面所述的液體進(jìn)樣速度，將會(huì)生成直徑大約為80前面的均一液滴。反應(yīng)區(qū)管道寬度為80μm，深度為50μm，長(zhǎng)度為1m。根據(jù)管道尺寸，液滴將會(huì)被略微壓扁，并一一排列在管道中，而反應(yīng)區(qū)管道長(zhǎng)度設(shè)計(jì)能夠同時(shí)容納下步驟1中所有進(jìn)樣試劑生成的液滴。反應(yīng)區(qū)內(nèi)走在最前面的是最先進(jìn)樣的A1編碼微液滴，其后面的是之后進(jìn)樣的A2功能液滴，后續(xù)的微液滴排列也以此類推。

步驟3 PCR反應(yīng)

將芯片放入PCR儀進(jìn)行在片的PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5℃10min預(yù)變性，95℃10s，55℃20s，72℃25s循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，最后4℃保溫。

步驟4液滴解碼與反應(yīng)結(jié)果讀取

經(jīng)過溫度循環(huán)的芯片從PCR儀中取出，并通過注射泵將礦物油通過B1和B2入口進(jìn)樣到芯片內(nèi)，這樣反應(yīng)區(qū)的液滴隊(duì)列就會(huì)繼續(xù)向出口方向移動(dòng)，并在到達(dá)出口前通過檢測(cè)區(qū)。在檢測(cè)區(qū)內(nèi)引入液滴熒光激發(fā)光源和檢測(cè)光路，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)液滴熒光的激發(fā)和檢測(cè)。不同類型的液滴具有不同的熒光強(qiáng)度，其中熒光最強(qiáng)的是編碼區(qū)的液滴，其次是經(jīng)過PCR反應(yīng)后，液滴內(nèi)原本就具有DNA模板并完成了擴(kuò)增的陽性液滴，還有原本不具有DNA模板因此未完成擴(kuò)增的陰性液滴，陰性液滴的熒光來自于液滴內(nèi)探針的背景熒光，熒光檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示。因此，通過識(shí)別液滴信號(hào)的強(qiáng)度，就能區(qū)分標(biāo)志液滴與功能液滴。

隊(duì)列中每個(gè)液滴會(huì)依次經(jīng)過檢測(cè)區(qū)，根據(jù)每個(gè)液滴的熒光強(qiáng)度，檢測(cè)系統(tǒng)也會(huì)檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的信號(hào)，而這些信號(hào)序列將會(huì)按先后順序被系統(tǒng)記錄，最后再進(jìn)行解碼和反應(yīng)結(jié)果判讀。液滴隊(duì)列中各個(gè)功能區(qū)與編碼區(qū)的排列順序是由步驟2決定的，是已知的，因此檢測(cè)隊(duì)列中各個(gè)標(biāo)志液滴的在整個(gè)信號(hào)序列中位置，就能解碼其相鄰的功能液滴所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)。如圖5所示，圖5是具有高熒光強(qiáng)度為特征的標(biāo)志液滴的編碼原理示意圖，其中標(biāo)志液滴具有高的熒光強(qiáng)度，因而在液滴熒光檢測(cè)時(shí)，通過對(duì)熒光強(qiáng)度的判斷就能區(qū)分出標(biāo)志液滴與功能液滴。通過確定標(biāo)志液滴1和標(biāo)志液滴2所在信號(hào)序列中的位置，就能確定夾在他們兩者當(dāng)中的信號(hào)序列是屬于功能液滴1的，從而完成對(duì)功能液滴1信號(hào)的提取和識(shí)別。同樣，通過識(shí)別后續(xù)的標(biāo)志液滴，就能完成所有功能區(qū)液滴信號(hào)的提取和識(shí)別，然后再對(duì)各個(gè)功能區(qū)信號(hào)進(jìn)行陰陽性液滴的判讀，完成對(duì)各個(gè)目標(biāo)分子的精確定量。

圖5具有高熒光強(qiáng)度為特征的標(biāo)志液滴的編碼原理示意圖，其中標(biāo)志液滴具有高的熒光強(qiáng)度，因而在液滴熒光檢測(cè)時(shí)，通過對(duì)熒光強(qiáng)度的判斷就能區(qū)分出標(biāo)志液滴與功能液滴。

實(shí)施例四以不同體積作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)

如圖6所示，圖6是以不同體積作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖；其中標(biāo)志液滴具有較大的體積，因而在液滴熒光檢測(cè)時(shí)，標(biāo)志液滴的熒光信號(hào)峰寬比較大，通過對(duì)信號(hào)峰寬的判斷就能區(qū)分出標(biāo)志液滴與功能液滴。

本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)需要四個(gè)步驟。

步驟1與實(shí)施例三中的步驟1大體相同，不同的是B1和B2進(jìn)樣速度有兩種情況，當(dāng)A1進(jìn)樣時(shí)，B1和B2的進(jìn)樣速度為100μL/h；當(dāng)A2、A3或A4進(jìn)樣時(shí)，B1和B2的進(jìn)樣速度為400μL/h。這樣就存在兩種油相和水相的流速比，會(huì)得到兩種大小不一樣的液滴，A1進(jìn)樣所生成的標(biāo)志液滴體積要比A2、A3和A4進(jìn)樣生成的功能液滴要大。

步驟2與實(shí)施例三中的步驟2大體相同，不同的是標(biāo)志液滴直徑約為110μm。

步驟3與實(shí)施例三中的步驟3相同。

步驟4與實(shí)施例三中的步驟4大體相同，不同的是對(duì)標(biāo)志液滴特征的檢測(cè)方法。由于標(biāo)志液滴體積比功能液滴的體積要大，因此經(jīng)過檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間更長(zhǎng)，檢測(cè)系統(tǒng)將讀取到更寬的熒光信號(hào)，最后檢測(cè)系統(tǒng)通過熒光信號(hào)峰寬識(shí)別標(biāo)志液滴，如圖6所示。

實(shí)施例五以不同顏色作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)

如圖7所示，以不同顏色作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標(biāo)志液滴具有紅色的特征，而A、B、C和D為無色透明的不同功能液滴，通過對(duì)液滴色彩信息的讀取能區(qū)分標(biāo)志液滴與功能液滴。

本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)需要四個(gè)步驟。

步驟1與實(shí)施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)裝載的是濃度為100μg/mL的水溶性胭脂紅色素溶液，用于生成標(biāo)志液滴。

步驟2與實(shí)施例三中的步驟2相同。

步驟3與實(shí)施例三中的步驟3相同。

步驟4與實(shí)施例三中的步驟4大體相同，不同的是對(duì)標(biāo)志液滴特征的檢測(cè)方法。由于標(biāo)志液滴具有特別的色彩信息，檢測(cè)系統(tǒng)通過對(duì)其特定的色彩信息進(jìn)行判讀來識(shí)別標(biāo)志液滴，如圖7所示。

實(shí)施例六以不同吸光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)

如圖8所示，圖8是以不同吸光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標(biāo)志液滴具有較高的吸光度，而A、B為無色透明的不同功能液滴，通過對(duì)液滴透射光強(qiáng)度的檢測(cè)，區(qū)分標(biāo)志液滴與功能液滴。

本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)需要四個(gè)步驟。

步驟1與實(shí)施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)裝載的是濃度為100μg/mL的亞甲基藍(lán)溶液，用于生成標(biāo)志液滴。

步驟2與實(shí)施例三中的步驟2相同。

步驟3與實(shí)施例三中的步驟3相同。

步驟4與實(shí)施例三中的步驟4大體相同，不同的是對(duì)標(biāo)志液滴特征的檢測(cè)方法。由于標(biāo)志液滴具有較高的吸光度，檢測(cè)系統(tǒng)通過對(duì)液滴發(fā)射相同強(qiáng)度的白光作為入射光，標(biāo)志液滴的吸光度強(qiáng)，因此從液滴另一側(cè)射出的透射光強(qiáng)度比功能液滴的弱，于是檢測(cè)透射光的強(qiáng)度能測(cè)量液滴的吸光度，通過判別不同的吸光度來識(shí)別標(biāo)志液滴，如圖8所示。

實(shí)施例七以不同反光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)

如圖9所示，圖9是以不同反光度作為標(biāo)志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標(biāo)志液滴具有較高的反光度，而功能液滴具有較低的反光度，通過檢測(cè)液滴的透射光與反射光強(qiáng)度來區(qū)分標(biāo)志液滴與功能液滴。

本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)的基因檢測(cè)需要四個(gè)步驟。

步驟1與實(shí)施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)裝載的是濃度約為10⁷/mL，直徑約為10約為的二氧化硅玻璃微珠懸濁液，用于生成標(biāo)志液滴。

步驟2與實(shí)施例三中的步驟2相同。

步驟3與實(shí)施例三中的步驟3相同。

步驟4與實(shí)施例三中的步驟4大體相同，不同的是對(duì)標(biāo)志液滴特征的檢測(cè)方法。由于標(biāo)志液滴具有較高的反光度，檢測(cè)系統(tǒng)通過對(duì)液滴發(fā)射相同強(qiáng)度的白光作為入射光，并在光源一側(cè)與對(duì)側(cè)分別安裝光強(qiáng)傳感器。標(biāo)志液滴的反光度強(qiáng)，因而能在光源側(cè)的光強(qiáng)傳感器上檢測(cè)到較強(qiáng)的反射光信號(hào)。而功能液滴反光度低，因而能在非光源側(cè)檢測(cè)到較強(qiáng)的透射光信息。通過判別不同的結(jié)果來識(shí)別標(biāo)志液滴，如圖9所示。

實(shí)施例八具有多種特征的標(biāo)志液滴的編碼方法

圖10具有多種特征的標(biāo)志液滴的編碼方法示意圖。其中A、B、C是不同的功能液滴，而編碼區(qū)的標(biāo)志液滴具有不同的特征和數(shù)量，形成不同的組合，這些特征包括實(shí)施例三到七中的一種或多種。

本實(shí)施例中液滴隊(duì)列的生成方式與實(shí)施例三中的類似，不同的是編碼區(qū)的標(biāo)志液滴可以不止一種，比如標(biāo)志液滴1是具有較強(qiáng)反射率的特征，而標(biāo)志液滴2則是具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。通過組合不同特征和數(shù)量的標(biāo)志液滴，形成每個(gè)編碼區(qū)都具有獨(dú)特的編碼特征，使得編碼信息更加豐富，編碼魯棒性更強(qiáng)，如圖10所示。

應(yīng)該理解到披露的本發(fā)明不僅僅限于描述的特定的方法、方案和物質(zhì)，因?yàn)檫@些均可變化。還應(yīng)理解這里所用的術(shù)語僅僅是為了描述特定的實(shí)施方式方案的目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受限于所附的權(quán)利要求。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，或者能夠確認(rèn)使用不超過常規(guī)實(shí)驗(yàn)，在本文中所述的本發(fā)明的具體的實(shí)施方案的許多等價(jià)物。這些等價(jià)物也包含在所附的權(quán)利要求中。