一種大鼠血漿中c4np的濃度檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種大鼠血漿中C4NP的濃度檢測方法，具體地說，涉及一種 UPLC-MSMS法檢測大鼠血漿中C4NP的濃度。
【背景技術(shù)】
[0002] CA4P(CombretastinnA4phosphate,cis-a-[3, 4, 5-trimethoxyphenyl]- 0 -[3 -hydroxy-4-methoxyphenyl])是天然產(chǎn)物CA4(combretastatinA4)的前藥。CA4 是從 從非洲叢林柳風(fēng)車藤屬caffrum的樹皮中提煉出來的一種雜環(huán)植物生物堿，因其可以減低 腫瘤血流量而被用作抗癌藥物[5-6]。CA4作為一種新型的抗腫瘤血管破壞劑（VDA)，可以 區(qū)分正常血管和腫瘤血管并選擇性破壞異常腫瘤血管，導(dǎo)致血管塌陷。CA4的結(jié)構(gòu)類似于 秋水仙堿，能強烈地結(jié)合到秋水仙堿結(jié)合位點上的微管蛋白，抑制微管組裝。組織學(xué)研宄 表明，幾個微管蛋白結(jié)合劑（如秋水仙堿，鬼白毒素，長春新堿，和長春堿），以及其它抗腫 瘤劑（例如，腫瘤壞死因子，黃酮乙酸，和相關(guān)的化合物）可誘導(dǎo)腫瘤血管損傷，然而，這樣 的有效作用劑量約達到最大耐受劑量（MTD)，這限制了這些試劑的適用性。與此相反，CA4P 在鼠模型中可以小于MI'D的十分之一的劑量誘導(dǎo)腫瘤中的血管損傷。CA4P是一種新型的 VDA抗腫瘤劑并且是第一個進入臨床的考布他汀類似物藥物。CA4P已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療甲 狀腺癌、卵巢癌，食道癌，小細胞肺癌和黑色素瘤。CA4P目前正在臨床試驗中（第三階段）， 以評估其與紫杉醇或卡鉑的組合是否能夠提高針對未分化甲狀腺癌的安全性和有效性。
[0003] C4NP是一種在CA4P的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改進的新的考布他汀類似物，在水溶液中穩(wěn)定。 C4NP有望成為一種新型的抗癌藥物。因此，其藥代動力學(xué)研宄對其進入臨床應(yīng)用是非常重 要的。傳統(tǒng)的用于定量的方法如高效液相色譜（HPLC)不滿足較短的運行時間和高靈敏度 的要求。近年來，超高效液相色譜（UPLC)取得顯著的進步，不僅加快了分析速度，還大大的 提高了峰值分辨率。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS)具有相對短的分析時間 和敏感高等特點，已被用作藥動學(xué)研宄的新型工具。
[0004] 這項研宄的目的是建立一種快速、靈敏的UPLC-MS/MS方法檢測C4NP在SD大鼠血 漿的濃度及其藥代動力學(xué)研宄。整個過程是在美國食品藥品管理局生物分析方法驗證的指 導(dǎo)方針下進行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種大鼠血漿中C4NP的濃度檢 測方法。其技術(shù)方案如下：
[0006] -種大鼠血漿中C4NP的濃度檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 1)配置濃度約為10yg/mL的C4NP溶液，進行質(zhì)譜條件優(yōu)化；
[0008] 2)C4NP進行色譜條件優(yōu)化以確定色譜柱、流動相組成及比例等條件；
[0009] 3)根據(jù)C4NP的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等條件選擇并優(yōu)化C4NP樣品前處理方法；
[0010] 4)建立C4NP的UPLC-MS/MS方法并進行方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容包括方法學(xué)專屬性、 線性、準(zhǔn)確度與精密度、提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)。
[0011] 進一步優(yōu)選，C4NP進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，離子源為ESI源；正離子SRM工作模 式；噴霧電壓：3500V;毛細管溫度：300°C;鞘氣：45arb;輔助氣：5arb;C4NP的離子對m/ Z:407 - 327 ;丁螺環(huán)酮離子對m/z:386 - 122,用作內(nèi)標(biāo)。進行色譜條件優(yōu)化，色譜柱： KinetexC18XB，流動相：水-乙腈，流速：0. 3mL/min;進樣量dOyL。（34NP的樣品前處理 方法采用簡單的蛋白沉淀法。將-80°C冷凍保存的血漿樣品90yL解凍，加入100ng/ mL內(nèi)標(biāo)IS溶液10yL，渦旋混勻，加入400yL甲醇，2000頻率振蕩lOmin。12000r/min， 4°C離心lOmin，后吸取上清液400yL，35°C下氮氣吹干，用100yL10%乙腈水溶液復(fù)溶， 2000 頻率振蕩 10min。12000r/min，4°C離心 10min，取 10yL上清液，UPLC-MS/MS進樣分 析。方法學(xué)驗證表明：在本實驗條件下，C4NP和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮均有較大的色譜峰，相互之 間沒有明顯的干擾，大鼠空白血漿中雜質(zhì)不干擾樣品峰。該方法專屬性較高。標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y =-0. 018641+0. 0264371X，r= 0. 9996,線性關(guān)系良好，定量下限為5. 703ng/mL，日內(nèi)和日 間精密度均< 15. 00%，準(zhǔn)確度在85. 00-115. 00%之間；低、中、高3個QC濃度中C4NP的提 取回收率在72. 86%~77. 86%之間，RSD均在15. 00%以內(nèi)，C4NP血漿樣品在4°C、25°C中 保存12h后穩(wěn)定，經(jīng)3次反復(fù)凍融后不受影響。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為：本實驗建立的大鼠血漿中C4NP的UPLC-MS/MS測定法，5個 不同來源的血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為5. 703~912. 533ng/mL， 線性關(guān)系良好；定量下限濃度為5. 703ng/mL;高、中、低三種濃度的日間和日內(nèi)差異均小于 15. 0% ;血漿樣品在稀釋500倍時，檢測準(zhǔn)確度符合要求。血漿樣品在4°C、25°C保存24h， 反復(fù)凍融3次以及-80°C冷凍保存2個月的穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，在本測定條件下，樣品較 穩(wěn)定，未見明顯變化。質(zhì)量控制樣品的測定結(jié)果表明測定的結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的，該方法符合 生物樣品分析要求。
【附圖說明】
[0013] 圖1為供試品C4NP的二級質(zhì)譜圖；
[0014] 圖2為內(nèi)標(biāo)（IS)的二級質(zhì)譜圖；
[0015] 圖3為C4NP血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0016] 圖4為空白血漿的UPLC/MS/MS色譜圖；
[0017] 圖5空白血漿樣品中添加C4NP(51. 33ng/mL)的UPLC-MS/MS色譜圖；
[0018] 圖6測試血漿樣品（低劑量1#號動物給藥后45min)的UPLC-MS/MS色譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
[0020] 1儀器與試劑
[0021] 1.1主要試驗儀器
[0022] 高壓液相色譜儀（配AthenaC18-WP色譜柱50X2.lmm, 3ym，美國waters公 司），TSQQuantum三重四級桿質(zhì)譜儀，配ESI源（美國Thermo公司），WatersACQUITYUPLC Console及ThermoLCquan軟件用于控制LC-MS/MS系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理與采集。MIKRO200R 高速冷凍離心機（Hettich)。
[0023] 1. 2主要試劑
[0024] 分析用C4NP標(biāo)準(zhǔn)品（純度99. 6%，含水量6. 3%，批號：20121204,上海第二 軍醫(yī)大學(xué)）；丁螺環(huán)酮（IS) (sigma，批號：33386-08-2);甲醇（質(zhì)譜純，美國Fisher Scientific);甲酸（色譜純，CNW);乙腈（質(zhì)譜純，美國Fisher Scientific);水為去離子 水。
[0025] 1. 3樣品處理及分析方法驗證
[0026]將-80°C冷凍保存的血漿樣品90yL解凍，加入內(nèi)標(biāo)IS溶液10yL(100ng/mL)， 渦旋混勻，加入400yL甲醇，2000頻率振蕩lOmin。離心10min(12000r/min，4°C)后吸取 上清液400yL，35°C下氮氣吹干，用100yL10%乙腈水溶液復(fù)溶，2000頻率振蕩lOmin。離 心lOmin(12000r/min，4°C)，取 10yL上清液，UPLC-MS/MS進樣分析。
[0027] 2. 2分析方法及驗證
[0028] 2. 2. 1分析方法
[0029] 2. 2. 1. 1色譜條件
[0030] 高壓液相色譜儀（waters);色譜柱：KinetexC18 XB (50mmX4. 6mm, i. d.，2.6ym);流動相：水（0.05%甲酸；A相）-乙腈（0.05%甲酸；B相），梯度見表1 ;流速： 0. 3mL/min ;進樣量：10yL。
[0031] 表1 C4NP流動相分析梯度
【主權(quán)項】
1. 一種大鼠血漿中C4NP的濃度檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 配置濃度為10 y g/mL的C4NP溶液，進行質(zhì)譜條件優(yōu)化； 2. C4NP進行色譜條件優(yōu)化以確定色譜柱、流動相組成及比例的條件； 3) 根據(jù)C4NP的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的條件選擇并優(yōu)化C4NP樣品前處理方法； 4) 建立C4NP的UPLC-MS/MS方法并進行方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容包括方法學(xué)專屬性、線 性、準(zhǔn)確度與精密度、提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠血漿中C4NP的濃度檢測方法，其特征在于， C4NP進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，離子源為ESI源；正離子SRM工作模式；噴霧電壓：3500V ; 毛細管溫度：300°C ;鞘氣：45arb ;輔助氣：5arb ;C4NP的離子對m/z:407 - 327 ;丁螺環(huán)酮 離子對m/z: 386 - 122,用作內(nèi)標(biāo)；進行色譜條件優(yōu)化，色譜柱：Kinetex C18XB，流動相： 水-乙腈，流速：〇. 3mL/min ;進樣量：10 y L ;C4NP的樣品前處理方法采用簡單的蛋白沉淀 法；將-80°C冷凍保存的血漿樣品90 y L解凍，加入lOOng/mL內(nèi)標(biāo)IS溶液10 y L，渦旋 混勾，加入400 yL甲醇，2000頻率振蕩IOmin ;12000r/min，4°C離心10min，后吸取上清液 400 yL，35°C下氮氣吹干，用100 ULlO %乙腈水溶液復(fù)溶，2000頻率振蕩IOmin ;12000r/ min，4°C離心10min，取IOy L上清液，UPLC-MS/MS進樣分析；方法學(xué)驗證表明：在本實驗 條件下，C4NP和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮均有較大的色譜峰，相互之間沒有明顯的干擾，大鼠空白血 漿中雜質(zhì)不干擾樣品峰；該方法專屬性較高；標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = -0. 018641+0. 0264371X，r = 0. 9996,線性關(guān)系良好，定量下限為5. 703ng/mL，日內(nèi)和日間精密度均< 15. 00 %，準(zhǔn)確度 在85. 00-115. 00%之間；低、中、高3個QC濃度中C4NP的提取回收率在72. 86%~77. 86% 之間，RSD均在15. 00%以內(nèi)，C4NP血漿樣品在4°C、25°C中保存12h后穩(wěn)定，經(jīng)3次反復(fù)凍 融后不受影響。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大鼠血漿中C4NP的濃度檢測方法，包括以下步驟：1)配置濃度約為10μg/mL的C4NP溶液，進行質(zhì)譜條件優(yōu)化；2)C4NP進行色譜條件優(yōu)化以確定色譜柱、流動相組成及比例等條件；3)根據(jù)C4NP的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等條件選擇并優(yōu)化C4NP樣品前處理方法；4)建立C4NP的UPLC-MS/MS方法并進行方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容包括方法學(xué)專屬性、線性、準(zhǔn)確度與精密度、提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)。該方法符合生物樣品分析要求。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104849367
【申請?zhí)枴緾N201510238157
【發(fā)明人】尚京川, 游娟娟, 辜鵬程
【申請人】重慶醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月11日