一種用于快速鑒定具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)、試劑盒及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速鑒定具條實(shí)蠅的 種特異性引物對(duì)、試劑盒及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 具條實(shí)繩，拉丁學(xué)名為：Bactrocerascutellata(Hendel)，屬雙翅目Diptera實(shí) 繩科Tephritidae果實(shí)繩屬Bactrocera，是一種重要的入侵檢疫性害蟲(chóng)。目前，具條實(shí)繩 在世界范圍的分布比較局限，主要分布在越南（龔秀澤，2003)、印度（梁日崇等，1985)、緬 甸（鄧裕亮等，2005)、老撾（鄧裕亮等，2010)、日本（梁廣勤等，1989;Miyatakeetal.， 2000)及韓國(guó)（Munetal.，2000)等地。我國(guó)是具條實(shí)蠅世界上具條實(shí)蠅的主要分布地區(qū) 之一，目前主要分布在臺(tái)灣、廣東、廣西、福建、浙江、江西、海南、云南、貴州、四川、湖北和陜 西（梁日崇等，1985;梁廣勤等，1989)。
[0003]具條實(shí)蠅危害的植物寄主非常廣泛，主要危害茄科植物及瓜類(lèi)，包括南瓜、絲瓜、 苦瓜、黃瓜、冬瓜、柑橘、柚、西瓜、木瓜、番茄、茄子、辣椒、番石榴、芒果等具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果 蔬。具條實(shí)蠅在植物組織內(nèi)部生長(zhǎng)發(fā)育，成蟲(chóng)只取食液態(tài)食物，幼蟲(chóng)植食性，在果實(shí)內(nèi)部取 食。由于其幼蟲(chóng)植食性，具條實(shí)蠅的經(jīng)濟(jì)重要性不僅能造成水果和蔬菜產(chǎn)量的直接銳減，增 加了防治的費(fèi)用，還影響水果蔬菜的進(jìn)出口貿(mào)易和增加建立控制和根除具條實(shí)蠅的費(fèi)用， 因此我國(guó)也將具條實(shí)蠅列為檢疫性害蟲(chóng)。近二十多年以來(lái)，具條實(shí)繩在我國(guó)的分布范圍急 劇擴(kuò)大，對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成很大影響，因此，非常有必要研究具條實(shí)蠅快速鑒定的新方法，實(shí) 現(xiàn)對(duì)具條實(shí)蠅的快速鑒定。
[0004] 由于對(duì)具條實(shí)蠅的成蟲(chóng)形態(tài)鑒別遠(yuǎn)比對(duì)幼蟲(chóng)、卵或蛹的鑒別容易，因此，為了保證 鑒定的準(zhǔn)確性目前的檢疫監(jiān)管機(jī)構(gòu)，通常采用的具條實(shí)蠅疫情的鑒別方法為形態(tài)學(xué)鑒別方 法，即：首先將截獲的實(shí)蠅幼蟲(chóng)、卵或蛹在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲(chóng)，然后通過(guò)觀(guān)察成蟲(chóng)形態(tài)，而鑒別 其是否為具條實(shí)蠅。該種鑒別方法存在的主要問(wèn)題為：（1)將幼蟲(chóng)、卵或蛹飼養(yǎng)為成蟲(chóng)，需 要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，嚴(yán)重影響了果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度；（2)如果截獲果蔬中實(shí)蠅的 頭、胸、腹、翅、足等殘?bào)w，由于無(wú)法將上述殘?bào)w飼養(yǎng)為成蟲(chóng)，因此，無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別所截獲的殘 體是否為具條實(shí)蠅的殘?bào)w，具有較大的鑒別局限性。
[0005]可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中，為了防止檢疫性具條實(shí)蠅傳入以及擴(kuò)散，迫切需要一種可克服 形態(tài)學(xué)鑒別方法的不足、能夠快速準(zhǔn)確鑒定具條實(shí)蠅的鑒別方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用于快速鑒定具條實(shí)蠅的種特異性引 物對(duì)、試劑盒及鑒定方法，能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)截獲的疑似具條實(shí)蠅的幼蟲(chóng)、卵、蛹，以及頭、 胸、翅、腹、足等殘?bào)w進(jìn)行鑒別。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供一種用于快速鑒定具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)，包括上游引物JF190 和下游引物JR386;
[0009] 所述上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0010] 所述下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種用于快速鑒定具條實(shí)蠅的試劑盒，所述試劑盒包括以下引物：
[0012] 上游引物JF190,其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0013] 下游引物JR386,其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種；所述試劑盒還包括標(biāo) 準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0015] 本發(fā)明還提供一種采用權(quán)利要求1所述的種特異性引物對(duì)快速鑒定具條實(shí)蠅的 方法，包括以下步驟：
[0016]S1，設(shè)計(jì)具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)；其中，所述具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)包括 上游引物JF190和下游引物JR386;
[0017] 其中，上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示；下游引物JR386的核苷 酸序列如SEQIDN0:2所示；
[0018]S2,提取被鑒定生物體的DNA;
[0019] S3,以S2提取的DNA為模板，使用S1得到的所述具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)進(jìn)行 SS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0020] S4,采用電泳檢測(cè)SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有197bp的 特征條帶，如果含有，則所述被鑒定生物體為具條實(shí)蠅種；反之，則所述被鑒定生物體不為 具條實(shí)蠅種。
[0021] 優(yōu)選的，S1中，通過(guò)以下方法設(shè)計(jì)得到具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)：
[0022] S1. 1，選用具條實(shí)蠅的標(biāo)本，采用試劑盒法從所述具條實(shí)蠅的標(biāo)本中提取具條實(shí) 蠅的基因組DNA。
[0023] 優(yōu)選的，S2中，所述被鑒定生物體的DNA具體為：來(lái)自卵生物形態(tài)的DNA、來(lái)自幼蟲(chóng) 生物形態(tài)的DNA、來(lái)自蛹生物形態(tài)的DNA、來(lái)自生物殘?bào)w的DNA;
[0024] 其中，所述生物殘?bào)w指頭、胸、腹、翅或足；
[0025] 此外，通過(guò)以下方法，提取被鑒定生物體的DNA:
[0026] 選用整只具條實(shí)蠅、或具條實(shí)蠅的殘?bào)w、或具條實(shí)蠅的卵、幼蟲(chóng)或蛹作為樣本；將 所選用的樣本置于2ml離心管中，加入液氮充分研磨；然后，將研磨后的樣本采用OMEGA E.Z.N.A.?InsectDNAKit試劑盒法提取DNA，并將最終提取到的DNA保存于-20°C備用。
[0027] 優(yōu)選的，S3中，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系以25ul計(jì)，包括：
[0028] 25.21x1 〇_kg/u丨模板I)NA 2ul 2:0uM上游引物JF190 lul 20uM下游引物JR386 lul 2^EasyTaqPC'RSuperMix 12.5ul ddH20 補(bǔ)足至 25ul。
[0029] 優(yōu)選的，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：93~95°C預(yù)變性4~6min;93~95°C 變性35~45s;退火溫度50~60°C，25~35s;72°C延伸0. 5~1. 5min;20~30個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸7~lOmin停止反應(yīng)。
[0030] 優(yōu)選的，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s;退火溫 度55°C，30s;72°C延伸lmin;30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min停止反應(yīng)。
[0031] 優(yōu)選的，S4中，所述采用電泳檢測(cè)SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是 否含有197bp的特征條帶，具體為：
[0032]S4. 1，提取SS-PCR擴(kuò)增后的5ul SS-PCR產(chǎn)物；
[0033] S4. 2,在含DNA染色劑的1. 5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上，對(duì)所述5ul SS-PCR 產(chǎn)物120V電泳30min ;
[0034]S4. 3,利用凝膠成像分析儀檢測(cè)電泳后是否擴(kuò)增出197bp的特征條帶。
[0035] SS-PCR產(chǎn)物測(cè)序：除了對(duì)SS-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查瓜實(shí)蠅特異引物 擴(kuò)增的特異片段是否與預(yù)期的一致外，本發(fā)明人還對(duì)特異引物的SS-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè) 序結(jié)果如下：
[0036] 5 ' -TAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGGAGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAATAAATAATATAAG ATTTTGACTACTGCCCCCTTCACTTACACTACTTTTAGTGAGCAGTATAGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGTTGAA CTGTTTACCCCCCTCTTTCATCAATTATTGCCCATGGAGGAGCATCTGTTGATC-3'
[0037] 本發(fā)明提供的用于快速鑒定具條實(shí)蠅的種特異性引物對(duì)、試劑盒及鑒定方法，具 有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0038] (1)種特異性引物對(duì)更加特異，只對(duì)具條實(shí)蠅具有擴(kuò)增能力，可擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為 197bp的特異條帶，而對(duì)其近源種無(wú)擴(kuò)增能力，擴(kuò)增效率更高，結(jié)果判斷更加直觀(guān)、便捷；
[0039] (2)PCR檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，一般可在8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)與鑒定，傳 統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中，需要飼養(yǎng)15天得到成蟲(chóng)再進(jìn)行鑒定；可見(jiàn)，本發(fā)明大大縮短了具條實(shí)蠅 的鑒定周期；
[0040] (3)本發(fā)明提供的種特異性引物對(duì)，具有較高的靈敏度，DNA濃度檢出限為 2. 889X10 4ng/uL，具有較高的實(shí)用價(jià)值，可以快速、準(zhǔn)確、特異性地檢測(cè)出具條實(shí)蠅的各個(gè) 蟲(chóng)態(tài)甚至殘?bào)w，具有檢測(cè)范圍大的優(yōu)點(diǎn)。
[0041]可見(jiàn)，本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定具條實(shí)蠅的方法，具有快速簡(jiǎn)便、特異性 尚、靈敏度尚等優(yōu)點(diǎn)，可以在8小時(shí)之內(nèi)完成具條實(shí)繩的鑒定，能夠滿(mǎn)足口岸檢驗(yàn)檢疫快速 通關(guān)的要求。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1為比較例一提供的通用型引物L(fēng)C01490和HC02198對(duì)提取的實(shí)蠅DNA模板進(jìn) 行質(zhì)量檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0043] 圖2為比較例一提供的引物JF190和JR386的種特異性驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0044] 圖3為比較例三提供的引物JF190和JR386的種特異性驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0045] 圖4為試驗(yàn)例一提供的引物JF190和JR386的靈敏度驗(yàn)證結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】