原種事件a5547-127以及在生物樣品中鑒定此類(lèi)事件的方法和試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】原種事件A5547-127以及在生物樣品中鑒定此類(lèi)事件的方 法和試劑盒
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年4月4日的、發(fā)明名稱(chēng)為"原種事件A5547-127以 及在生物樣品中鑒定此類(lèi)事件的方法和試劑盒"的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200680011600. 1 (PCT/ EP2006/003455)的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及鑒定在生物樣品中存在包含特定轉(zhuǎn)化事件A5547-127的植物材料，以 及包含此類(lèi)事件的轉(zhuǎn)基因大豆植物、植物材料和種子的方法和試劑盒。本發(fā)明的大豆植物 將除草劑耐受表型與農(nóng)藝學(xué)特征、遺傳穩(wěn)定性和對(duì)不同遺傳背景的適應(yīng)性結(jié)合在一起，等 同于缺乏雜草壓力的非轉(zhuǎn)化大豆品系。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 在植物中轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)依據(jù)基因自身結(jié)構(gòu)和其在植物基因組中的位置而決 定。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因（外源DNA)存在于基因組的不同位置將以不同方式影響植物的整體表 型。在農(nóng)藝學(xué)或工業(yè)上，通過(guò)基因操作向植物中成功引入商業(yè)上感興趣的性狀是一個(gè)依賴(lài) 于不同因素的漫長(zhǎng)過(guò)程。遺傳轉(zhuǎn)化的植物實(shí)際上的轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第 一步，這一系列步驟包括廣泛的遺傳特征鑒定、育種和田間試驗(yàn)的評(píng)估，最終導(dǎo)致原種事件 的選擇。
[0005] 考慮到在新食品/飼料、GM0和非GM0產(chǎn)品的分離以及獨(dú)有材料的鑒定方面的討 論，對(duì)于原種事件的明確鑒定變得日益重要。理想的此類(lèi)鑒定方法是既迅速又簡(jiǎn)單、不需要 很多的實(shí)驗(yàn)室裝置。此外，該方法應(yīng)該提供在沒(méi)有專(zhuān)家解釋的情況下允許明確鑒定原種事 件的結(jié)果，但是如果需要可以展示給專(zhuān)家詳察。
[0006] 通過(guò)用包含編碼耐受膦絲菌素的合成pat基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大豆，選擇A5547-127 作為在大豆（GlycinemaxL.)發(fā)育中對(duì)抗除草劑liberty?的原種事件，并且可以作為 LibertyLink?大豆商業(yè)銷(xiāo)售。這里描述在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的簡(jiǎn)單 和明確的方法中使用的手段。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其基于特異性識(shí)別 A5547-127的5'和/或3'側(cè)翼序列的引物或探針。
[0009] 更具體地，本發(fā)明涉及方法，其包含擴(kuò)增生物樣品中存在的核酸序列，即使用至少 兩種引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中一種引物識(shí)別A5547-127的5'或3'側(cè)翼區(qū)，另外一種 引物識(shí)別外源DNA中的序列，優(yōu)選獲得的DNA片段在100和500bp之間。引物可以分別識(shí)別 A5547-127的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列（SEQID No. 1，從1-311位點(diǎn)）或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列（SEQ ID No. 2從510-1880位點(diǎn)的互補(bǔ)序列）和外源DNA內(nèi)的序列（SEQID No 1從312-810位 點(diǎn)的互補(bǔ)序列或SEQID No 2從1-510位點(diǎn)）。此處所描述的識(shí)別5'側(cè)翼區(qū)的引物可能包 含SEQID No. 15的核苷酸序列，且識(shí)別外源DNA內(nèi)序列的引物可能包含SEQID No. 13的 核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明更具體涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其包含擴(kuò)增生 物樣品中存在的核酸序列，即使用分別含有SEQIDNo. 15和SEQIDNo. 13的核苷酸序列 的兩種引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得的DNA片段約為151bp。
[0011] 本發(fā)明還涉及此處描述的A5547-127的特異側(cè)翼序列，可以用其發(fā)展在生物樣品 中特異鑒別A5547-127的方法。更具體地，本發(fā)明涉及A5547-127的5'和/或3'側(cè)翼區(qū)，可 以用其發(fā)展此處進(jìn)一步描述的特異引物和探針。本發(fā)明還涉及生物樣品中存在A5547-127 的鑒定方法，其基于使用此類(lèi)特異引物或探針。引物可以由17到約200個(gè)連續(xù)的核苷酸序 列（選自SEQIDNo1從1-311核苷酸序列、或SEQID2從510-1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸 序列）組成，與由17到約200個(gè)連續(xù)的核苷酸序列的引物（選自SEQIDNo1從312-810 核苷酸、或SEQIDNo2從1-510核苷酸的互補(bǔ)序列）組合使用。引物也可以在它們的3' 末端包含這些核苷酸序列，并且引物還包含非相關(guān)序列或從所述核苷酸序列衍生而來(lái)、但 是含有錯(cuò)配的序列。
[0012] 本發(fā)明還涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包括 至少一種引物或探針，其特異性識(shí)別A5547-127的5'或3'側(cè)翼區(qū)。
[0013] 本發(fā)明的試劑盒除包含特異性識(shí)別A5547-127的5'或3'側(cè)翼區(qū)的引物以外，可 能還包含第二種引物用于PCR鑒定方法，所述第二種引物特異性識(shí)別A5547-127的外源DNA 內(nèi)的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含兩種特異引物，其中一種識(shí)別A5547-127的5'側(cè) 翼區(qū)內(nèi)的序列，而其中另一種識(shí)別外源DNA內(nèi)的序列。特別是識(shí)別5'側(cè)翼區(qū)的引物可能包 含SEQIDNo. 14的核苷酸序列，并且識(shí)別轉(zhuǎn)基因的引物可能包含SEQIDNo. 13的核苷酸 序列或任何此處所描述的其它引物。
[0014] 本發(fā)明還涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包 含具有SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 15的核苷酸序列的PCR引物，用于此處所描述的 A5547-127PCR鑒定方法。
[0015] 本發(fā)明也涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包含 特異性探針，該探針具有與A5547-127特定區(qū)域有80%到100 %序列同一性的序列的相應(yīng) (或互補(bǔ)）序列。優(yōu)選的探針序列相應(yīng)于包含部分A5547-127的5'或3'側(cè)翼區(qū)的特定區(qū) 域。更優(yōu)選的特異性探針具有（或互補(bǔ)于）與SEQIDNo. 1的360到460核苷酸或SEQID No. 2的460到560核苷酸序列有80%到100%序列同一性的序列。
[0016] 本發(fā)明包括的方法和試劑盒可用于不同的目的，例如（但是并不限于）如下所示： 在植物、植物材料或產(chǎn)品中鑒定A5547-127的存在或缺失，其中產(chǎn)品是例如（但不限于）包 含植物材料的或從植物材料衍生的食物或飼料產(chǎn)品（新鮮的或經(jīng)處理的）；另外或可選擇 地，本發(fā)明的方法和試劑盒可被用于以分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料為目的的轉(zhuǎn)基因植物材 料鑒定；另外或可選擇地，本發(fā)明的方法和試劑盒可被用于測(cè)定包含A5547-127的植物材 料的質(zhì)量（即純材料的百分?jǐn)?shù)）。
[0017] 本發(fā)明還涉及A5547-127的5'和/或3'側(cè)翼區(qū)，以及從A5547-127的5'和/或 3'側(cè)翼序列發(fā)展而來(lái)的特異引物和探針。
[0018] 本發(fā)明也涉及包含原種事件A5547-127的大豆植物、其部分、細(xì)胞、種子和子代植 物。此類(lèi)植物、其部分、細(xì)胞、種子和子代植物可以使用此處所描述的方法來(lái)鑒定。
[0019] 發(fā)明詳述
[0020] 通常由細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化（或通過(guò)另外的基因操作）產(chǎn)生重組DNA分子摻入到植 物基因組中。摻入的特定位置是由于"隨機(jī)"整合決定或在預(yù)定位置（如果使用靶向整合 方法）。
[0021] 通過(guò)用重組DNA或"轉(zhuǎn)化DNA"轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織而導(dǎo)致引入DNA到植物基因組， 且來(lái)源于此類(lèi)轉(zhuǎn)化DNA的DNA在下文被稱(chēng)為"外源DNA"，其含有一個(gè)或多個(gè)"轉(zhuǎn)基因"。在 本發(fā)明中，"植物DNA"指來(lái)源于被轉(zhuǎn)化植物的DNA。植物DNA通常被發(fā)現(xiàn)位于相應(yīng)野生型植 物相同的遺傳位點(diǎn)。外源DNA的特征在于重組DNA分子在植物基因組中摻入位點(diǎn)的位置和 構(gòu)象。重組DNA插入植物基因組的位點(diǎn)也被稱(chēng)為"插入位點(diǎn)"或"靶位點(diǎn)"。重組DNA插入植 物基因組中可以與植物DNA的缺失聯(lián)系在一起，稱(chēng)為"靶位缺失"。此處所使用的"側(cè)翼區(qū)" 或"側(cè)翼序列"指至少20bp，優(yōu)選至少50bp，和直到5000bp的植物基因組序列，其位于外源 DNA鄰近上游、或鄰近下游，并且都與外源DNA鄰接。轉(zhuǎn)化過(guò)程導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合，從而 產(chǎn)生帶有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，所述側(cè)翼區(qū)對(duì)于每種轉(zhuǎn)化體是特征性的且獨(dú)特的。當(dāng)重組 DNA通過(guò)傳統(tǒng)雜交被引入植物中時(shí)，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)、或其側(cè)翼區(qū)通常不會(huì)被 改變。此處所使用的"插入?yún)^(qū)"指相應(yīng)于至少40bp，優(yōu)選至少100bp，和直到lOOOObp的區(qū) 域，包含植物基因組中外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列?？紤]到由于物種內(nèi)突變?cè)?成的微小差別，與同種植物雜交時(shí)，插入?yún)^(qū)將保持與包含原來(lái)從轉(zhuǎn)化獲得的植物中外源DNA 上游和下游側(cè)翼區(qū)序列具有至少85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%和最優(yōu)選100%的序列同一 性。
[0022] 事件定義為（人工的）遺傳位點(diǎn)，其由于基因工程而攜帶包含至少一個(gè)拷貝目的 基因的轉(zhuǎn)基因。事件典型的等位基因狀態(tài)為存在或缺失外源DNA。事件的表型特征在于轉(zhuǎn) 基因的表達(dá)。在遺傳水平上，事件是植物遺傳組成的部分。在分子水平上，事件的特征在于 限制性酶切圖譜（例如通過(guò)Southern印跡確定）、轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列、轉(zhuǎn)基 因的分子標(biāo)記的位置和/或分子構(gòu)象。通常用包含至少一個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物 會(huì)導(dǎo)致多重事件，其中每個(gè)事件都是唯一的。
[0023] 此處所使用的原種事件是選自一組事件中的事件，其通過(guò)用相同的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn) 化、或通過(guò)用此種轉(zhuǎn)化所獲得的植物回交而獲得，基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性、及其與包含 它的植物的最適農(nóng)藝學(xué)特性的相容性。因此原種事件的篩選標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選兩個(gè) 或多個(gè)、有利地包含所有如下標(biāo)準(zhǔn)：
[0024] a)外源DNA的存在不會(huì)危害植物的其它所希望的特性，例如那些有關(guān)農(nóng)業(yè)操作或 商業(yè)價(jià)值的特性；
[0025] b)事件的特征在于良好的確定的分子構(gòu)象，其可以穩(wěn)定遺傳并且可以對(duì)其發(fā)展作 為鑒定對(duì)照的適當(dāng)手段；
[0026] c)在事件為雜合子（或半合子）和純合子條件下，在攜帶事件的植物可能暴露于 正常農(nóng)業(yè)使用的環(huán)境條件范圍內(nèi)以商業(yè)上可接受的水平，目的基因展示正確的、適當(dāng)和穩(wěn) 定的時(shí)空表型表達(dá)。
[0027] 優(yōu)選的外源DNA與植物基因組中的位置相關(guān)聯(lián)，該位置允許基因容易的漸滲到希 望的商業(yè)遺傳背景中。
[0028] 事件作為原種事件狀態(tài)的確認(rèn)是通過(guò)原種事件漸滲到不同相關(guān)的遺傳背景中，并 且觀察其依從例如上述a)、b)和c)中一個(gè)、兩個(gè)或全部的標(biāo)準(zhǔn)。
[0029] 因此"原種事件"指包含外源DNA的遺傳位點(diǎn)，其符合上述標(biāo)準(zhǔn)。植物、植物材料 或子代例如種子，在其基因組中可以包含一個(gè)或多個(gè)原種事件。
[0030]用于鑒定原種事件或包含原種事件的植物、植物材料、或含有植物材料的產(chǎn)品的 方法基于原種事件的特定基因組特性，例如包含外源DNA的基因組區(qū)域的特異限制性酶切 圖譜、分子標(biāo)記或外源DNA側(cè)翼區(qū)序列。
[0031] -旦外源DNA的一個(gè)或兩個(gè)側(cè)翼區(qū)被測(cè)序，就可經(jīng)由分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)發(fā)展特異 性識(shí)別樣品中核酸（DNA或RNA)的這個(gè)（這些）序列的引物和探針。例如PCR方法可以用 于鑒定生物樣品中（例如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品）的原種事件。此 類(lèi)PCR基于至少兩種特異性"引物"，一種識(shí)別原種事件的5'或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另外一 種識(shí)別外源DNA內(nèi)的序列。引物優(yōu)選具有15-35個(gè)核苷酸的序列，其在最適PCR條件下分 另IJ"特異性識(shí)別"原種事件的5'或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列和原種事件的外源DNA，以便從包含 原種事件的核酸樣品中擴(kuò)增出特異性片段（"整合片段"或識(shí)別的擴(kuò)增子）。這表示在最佳 PCR條件下擴(kuò)增的只有定向整合片段，而沒(méi)有植物基因組或外源DNA的其它序列。
[0032] 適合本發(fā)明的PCR引物可能為如下：
[0033] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自5'側(cè)翼序 列（SEQIDNo1從1到311核苷酸）的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸 (識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物）；或者
[0034] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自3'側(cè)翼序 列（SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)序列）的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20 個(gè)連續(xù)的核苷酸（識(shí)別3'側(cè)翼序列的引物）；或者
[0035] -長(zhǎng)度在17nt到約510nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自插入DNA序 列（SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)序列）的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè) 連續(xù)的核苷酸（識(shí)別外源DNA的引物）；或者
[0036] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，包含選自插入DNA序列（SEQIDNo2 從1到509核苷酸）的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)核苷酸。
[0037] 引物當(dāng)然可以比所述的17個(gè)連續(xù)核苷酸更長(zhǎng)，長(zhǎng)度可以是例如20、21、30、35、50、 75、100、150、200nt或更長(zhǎng)。引物可以完全由選自所述側(cè)翼序列和外源DNA序列的核苷酸 序列組成。然而，引物5'末端（即在位于3'端的17個(gè)連續(xù)核苷酸之外）的核苷酸序列并 不是決定性的。因此，引物的5'序列可以由選自側(cè)翼序列或外源DNA的核苷酸序列組成， 但是適當(dāng)?shù)目梢院幸恍╁e(cuò)配（例如1、2、5、10個(gè)錯(cuò)配）。引物的5'序列甚至可以完全包 括與側(cè)翼序列或外源DNA無(wú)關(guān)的核苷酸序列，例如代表限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序 列。此類(lèi)無(wú)關(guān)的序列或帶有錯(cuò)配的側(cè)翼DNA序列應(yīng)該優(yōu)選長(zhǎng)度不超過(guò)100個(gè)核苷酸，更優(yōu) 選不超過(guò)50個(gè)或甚至25個(gè)核苷酸。
[0038] 而且，假如所述位于3'端的17個(gè)連續(xù)核苷酸并非從外源DNA或SEQIDNo1或2 中由植物衍生序列唯一衍生而來(lái)的，那么合適的引物可能包含或由在其3'末端跨植物DNA 衍生序列和外源DNA序列（位于SEQIDNo1的311-312核苷酸和SEQIDNo2的509-510 核苷酸）之間連接區(qū)的核苷酸序列組成。
[0039] 因此，適合本發(fā)明的PCR引物也可能如下：
[0040] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自SEQ ID No 1從1到325核苷酸的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列；或
[0041] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自SEQ ID No 2從495到1880核苷酸的互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷 酸序列；或
[0042] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自SEQ ID No 1從295到810核苷酸的互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸 序列；或
[0043] -長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，包含選自SEQ ID No 2從1到525核 苷酸的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。
[0044] 熟練的技術(shù)人員也會(huì)立刻清楚所選的適當(dāng)PCR引物對(duì)也應(yīng)該不包含彼此互補(bǔ)的 序列。
[0045] 出于本發(fā)明的目的，"SEQ ID N〇:X代表的核苷酸序列的互補(bǔ)序列"所指的核苷酸 是根據(jù)Chargaff規(guī)則G'l-T; 通過(guò)用其互補(bǔ)的核苷酸取代，并以5'到3'方向 (即以所代表的核苷酸序列相反的方向）讀碼，從所代表的核苷酸序列衍生而來(lái)的核苷酸 序列。
[0046] 適當(dāng)?shù)囊锏膶?shí)例是SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5(識(shí)別5'側(cè)翼序 列的引物）、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10(識(shí)別 外源DNA的