癌癥基因突變及基因擴增檢測的制作方法
【專利說明】癌癥基因突變及基因擴增檢測 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥突變高發(fā)基因的檢測。本發(fā)明提供了基于多重PCR和高通量測序 技術的用于癌癥樣品的多基因、多位點突變檢測的引物組、試劑盒和檢測方法。所提供的檢 測結(jié)果例如可用于輔助診斷或指導臨床用藥方案。
【背景技術】
[0002] 癌癥是全球最主要的非傳染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病，我國 每年因癌癥死亡的人數(shù)就高達270萬，其中W肺癌及胃癌、結(jié)直腸癌等消化道腫瘤最為嚴 重，而女性中W乳腺癌為首的婦科腫瘤也是癌癥死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，我國肺癌的發(fā)病 率為53. 57/10萬，死亡率高達45. 57/10萬，均處于所有惡性腫瘤之首，胃癌則W 36. 21/10 萬的發(fā)病率僅次之，而乳腺癌W 42. 55/10萬的發(fā)病率處于女性腫瘤之首。
[0003] 抗腫瘤祀向藥物是目前治療癌癥較為有效的一種手段，2013年全球銷量前十大 藥物近一半為抗腫瘤祀向藥物，抗腫瘤祀向藥物和其他化療藥物療效和毒副作用都因人 而異，該是因為本質(zhì)上講，癌癥是一種多基因突變造成的疾病。關鍵基因的突變、截斷、錯 位或融合等導致腫瘤發(fā)生。由于無節(jié)制增長，腫瘤細胞發(fā)生了更多的基因突變，導致腫瘤 惡性化程度加深、轉(zhuǎn)移和抵抗治療，識別個體腫瘤特異性的驅(qū)動基因突變就成了有效的選 擇祀向藥物應用的關鍵。目前NCCN(美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡）已對多種祀向藥物使用作 出規(guī)定，建議其在用于腫瘤治療前進行基因突變檢測W確定是否適合用藥，例如吉非替尼 (gefitinib)、曲妥珠單抗等（Trastuzum油）。
[0004] 隨著科技發(fā)展，抗腫瘤藥物的發(fā)展也表現(xiàn)出藥物使用從單一到聯(lián)合的趨勢。W 前祀向藥物W單藥加化療為主，但大多數(shù)腫瘤是多基因疾病，針對單個祀點治療雖然能延 長生存，但很少能根治，故目前多個祀向藥物的聯(lián)合治療研究越來越多，最成功的例子就是 BRAF和MEK抑巧驚U聯(lián)合治療黑色素瘤。因此，同時能快捷地檢測多個藥物祀點基因檢測方 法就變得尤為重要，結(jié)合高通量測序的完全個體化的基因治療也被認為是腫瘤治療最終努 力的方向。
[0005] 常見的癌癥相關基因包括下列基因：
[0006] BRAF基因編碼B-Raf蛋白。BRAF基因突變常見于黑色素瘤（50% )、非小細胞肺 癌（1-3%)，結(jié)直腸癌巧-15%)、腦膠質(zhì)瘤（4.0%)、卵巢癌（11%)及胃間質(zhì)瘤等高發(fā)腫 瘤中，其中W 15號外顯子的V600E突變尤為常見。
[0007] EGFR巧pidermal Growth Factor Rec巧tor)為表皮生長因子受體，屬于受體酪氨 酸激酶（RTKs)家族。EGFR中的突變在非小細胞肺癌患者中的發(fā)生頻率高達35%，主要發(fā) 生在18、19、20和21號外顯子上，而又^19號外顯子的9.6746_4750(16化11?64突變和21 號外顯子上的P.L858R突變最為常見。此外，EGFR中的突變還見于腦膠質(zhì)瘤（26% )和胃 腺癌（10%)中。EGFR中的突變可直接激活細胞下游的多種信號途徑，包括與細胞存活相 關的PI3K-AKT-mT0R途徑，W及與細胞增殖相關的RAS-RAF-MEK-E服途徑。
[000引 KRAS基因編碼K-Ras蛋白。KRAS基因突變多發(fā)于非小細胞肺癌（15-25% )、結(jié) 直腸癌（36 - 40%)、卵巢癌（14%)及甲狀腺癌等腫瘤中，主要發(fā)生在第2、3號外顯子上， KRAS突變可導致RAS GTP酶的組成性激活，該種激活狀態(tài)不受生長因子信號的調(diào)控，該一 結(jié)果導致細胞的持續(xù)增殖，并使EGFR TKI類藥物效果降低。
[0009] PIK3CA基因編碼pllOa蛋白，其為組成磯脂醜-3-激酶（PI3K)的催化亞基之一。 PI3K可參與激活下游的某些重要的信號蛋白，如AKT等。PIK3CA基因的突變主要發(fā)生在第9 和20號外顯子，常發(fā)生于非小細胞肺癌（1-3%)、乳腺癌（26%)、結(jié)直腸癌（10-30%)、 卵巢癌化.7% )等腫瘤中，有研究認為PIK3CA的激活突變可能和癌細胞對EGFR TKI類藥 物產(chǎn)生抗性有關。
[0010] 肥R2(又稱化bB2)基因與EGFR-樣同屬于受體酪氨酸激酶家族，其基因突變常見 于非小細胞肺癌（2-4%)及乳腺癌（2%)中，而其擴增突變常發(fā)生于多種腫瘤如乳腺癌 (18%)、胃癌（7~34%)、結(jié)直腸癌（3%)、食管癌（15%)及肺癌（22.8%)中。肥R2的 突變可激活細胞下游多種信號途徑，包括涉及細胞存活的PI3K-AKT-mT0R途徑和涉及細胞 增殖的RAS-RAF-MEK-E服途徑。
[OOU]目前已有不少針對上述基因的藥物，如針對EGFR基因為祀點的有吉非替 尼（gefitinib)、厄洛替尼巧rlotinib)，針對BRAF基因突變的藥物有維羅非尼 (Vemurafenib)、達拉非尼（ckbrafenib)，針對肥R2基因突變或擴增的有拉帕替尼 (Lapatinib)、阿法替尼（Afatinib) W及曲妥珠單抗（Trastuzumab)等。
[0012] DNA堿基突變（包括點突變、插入突變和刪除突變等）和基因擴增突變（即基因拷 貝數(shù)增加）是腫瘤細胞中最常見的兩種突變方式，也是在相關藥物研發(fā)中常用的祀標。目 前常見的檢測多基因突變的方法主要有英光PCR法和一代Sanger測序法。英光PCR法具 有靈敏度高的特點，且技術已經(jīng)成熟，應用廣泛，但是每對引物只能檢測一種突變，且每種 突變需要單獨建立一個PCR反應體系，導致樣品用量較大，且無法同時檢測大量的樣品或 位點；一代Sanger測序法單對引物可檢測多個突變，具有成本低等特點，但每次擴增只能 使用一對引物，無法同時檢測多個基因或多個樣品，而且所需樣品量大，且對低頻突變的檢 測不夠令人滿意。
[0013] 傳統(tǒng)的檢測基因擴增的經(jīng)典方法為FISH(英光原位雜交技術），該技術有較好的 靈敏度，其最大的優(yōu)點是可直觀地在細胞核層面觀察基因擴增情況，并且可通過英光的亮 度強弱來推測基因拷貝數(shù)的多少，但是該方法成本較高，對技術人員的操作也有較高要求， 且其結(jié)果判斷容易受多種因素影響，如多倍體細胞等等。
[0014] 多重PCR技術目前在多基因多位點的擴增上有較好的應化而相比普通PCR其也 具有高效、可對模版定量或定性等優(yōu)點，但其體系構(gòu)建需綜合目標序列的同源性和長短、引 物動力學、PCR反應條件優(yōu)化等多種因素，例如目標序列的長度范圍太大可能導致擴增效率 不均勻，引物濃度配比不當或者引物間形成易形成二聚體均可影響總體擴增效率或者擴增 均勻性，目前市場上或者實驗中同一體系一般較少超過同時存在五至六對引物的情況，由 此可見其在技術實現(xiàn)上具有相當難度和要求。
[0015] 因此，仍然需要進一步開發(fā)對DNA堿基突變和基因擴增突變的檢測工具，W實現(xiàn) 對癌癥驅(qū)動基因的更有效、更準確的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 除非另外說明，本申請中的各個術語的含義與本領域技術人員通常理解的含義相 同。
[0017] 本發(fā)明基于多重PCR和高通量測序技術開發(fā)出用于同時檢測樣品中一個或多個 癌癥驅(qū)動基因的兩個或更多個外顯子的多個區(qū)域突變的引物組、試劑盒和檢測方法。所述 癌癥驅(qū)動基因特別是BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或肥R2基因。所述突變可W是一個或 多個堿基的插入、取代和/或缺失，或基因擴增突變。
[0018] 本發(fā)明的檢測引物可用于擴增8^。、66。3、1(^5、？11(3〔4和/或肥1?2基因的外顯 子上的相應區(qū)域，然后將擴增的目標片段進行高通量測序，獲得目標片段的序列信息，并由 此獲得突變檢測結(jié)果。
[0019] 因此，本發(fā)明的目的是提供用于同時檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的兩個 或更多個外顯子的多個區(qū)域突變的引物組；包含該引物組的試劑盒；使用所述引物組和/ 或試劑盒擴增所述癌癥驅(qū)動基因或檢測所述癌癥驅(qū)動基因的外顯子突變的方法。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的一個或 多個外顯子的突變的引物組，包含用于在一個多重PCR中同時擴增選自BRAF、EGFR、KRAS、 PIK3CA和/或肥R2基因的一個或多個基因的一個或多個外顯子的多個區(qū)域的檢測引物對， 其包含選自表1引物對中的至少3對引物：
[0021] 表1檢測引物對
[0022]
【主權(quán)項】
1. 用于檢測樣品中一個或多個癌癥驅(qū)動基因的一個或多個外顯子的突變的引物組，包 含用于在一個多重？〇?中同時擴增選自8狀?36?1?、1(狀5、？11(304和/或冊1?2基因的一個 或多個基因的一個或多個外顯子的多個區(qū)域的檢測引物對，其包含選自下列引物對中的至 少3對、至少4對、至少5對、至少6對、至少7對、至少8對、至少9對、至少10對、至少11 對、至少12對、至少13對、至少14對、或全部15對引物： 用于擴增BRAF基因的外顯子11的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID ΝΟ:1和2所示； 用于擴增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:3和4所示； 用于擴增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:5和6所示； 用于擴增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:7和8所示； 用于擴增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO:9和10所示； 用于擴增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 11和12所示； 用于擴增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 13和14所示； 用于擴增KRAS基因的外顯子3的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 15和16所示； 用于擴增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 17和18所示； 用于擴增PIK3CA基因的外顯子9的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID NO: 19和20所 示； 用于擴增PIK3CA基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:21和22所 示； 用于擴增HER2基因的外顯子19的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:23和24所示； 用于擴增HER2基因的外顯子20的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:25和26所示； 用于擴增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:27和28所示； 和/或 用于擴增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對，其序列如SEQ ID N0:29和30所示。
2. 權(quán)利要求1的引物組，其中所述多重PCR的反應條件為99°C預熱2min，每個循環(huán) 99°C變性15s，60°C退火4min，共23個循環(huán)，最后儲存于KTC備用。
3. 權(quán)利要求1或2的引物組，其進一步包含用