腸道病毒71型3cd嵌合病毒及其拯救方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種腸道病毒71型3⑶嵌合病毒及其拯救方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報(bào)道。1957年在新西 蘭首次報(bào)道，1958年首次分離出柯薩奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期發(fā)現(xiàn) 的手足口病的病原體主要為CoxA16型，手足口病與EV71感染有關(guān)的報(bào)道開始于20世紀(jì) 70年代初，1972年EV71首次在美國(guó)確認(rèn)。此后EV71感染與CoxA16感染交替出現(xiàn)，成為 手足口病的主要病原體。其多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù) 患兒可引起肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展較快，導(dǎo)致死亡。重 癥和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。
[0003] 腸道病毒71型?V71)屬于小RNA病毒科（Picornaradae)腸道病毒屬 (Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。EV71抗體在成人血清中的陽(yáng)性率達(dá)到65% 以上，說(shuō)明了這種病毒的廣泛傳播，每年春夏季溫度升高時(shí)都會(huì)進(jìn)入感染高峰期，流行趨勢(shì) 從散發(fā)逐漸趨于有小型聚集性爆發(fā)。
[0004] 手足口病的相關(guān)科研工作起步較晚，發(fā)達(dá)國(guó)家擁有較好的科研平臺(tái)，亞太地區(qū)為 主要流行區(qū)域，但對(duì)EV71的基礎(chǔ)研究投入不夠，至今在臨床上還沒(méi)有有效的疫苗和藥物， 對(duì)EV71進(jìn)行有效的預(yù)防和控制。由于腸道病毒71型屬于小RNA病毒科，所以其基因組的 人工操作較難，這給疫苗的制備增加了難度。
[0005] 因此目前對(duì)EV71的疫苗研究仍主要聚焦在傳統(tǒng)的滅活疫苗上，而此類疫苗的免 疫效果一般較低；雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生包括中和抗體在內(nèi)的免疫反應(yīng)，但不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短，需要多次接種；需要使用佐劑，制劑中 存在滅活劑，滅活劑對(duì)病毒抗原有影響；由于誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平較低，以及各個(gè)抗原成分 之間的疫苗應(yīng)答不平衡，可能誘發(fā)疾病；一般不能通過(guò)自然途徑接種，不易產(chǎn)生局部免疫反 應(yīng)。由于以上問(wèn)題的存在，亟需研發(fā)新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫應(yīng) 答，又能避免感染性。此類疫苗的研制，需要對(duì)病毒基因組中各基因編碼區(qū)域的功能進(jìn)行深 入研究和了解，這種深入了解還有助于篩選抗病毒藥物的靶點(diǎn)研究。
[0006] 反向遺傳學(xué)方法研究RNA病毒，是在質(zhì)粒水平上來(lái)操作、研究RNA病毒，獲得的拯 救病毒表型穩(wěn)定，操作方便，為EV71的深入研究提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)平臺(tái)。但迄今還沒(méi) 有合適的病毒作為疫苗研究的工具。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技術(shù)偏見(jiàn)EV71的反向遺 傳學(xué)研究是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，此外由于EV71拯救病毒是一種新的病毒，所以在研究拯救方法時(shí) 就存在很大的不可預(yù)期性，如何克服這種不可預(yù)期性是現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法做到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是為了提供一種腸道病毒71型3CD嵌合病毒及其拯救方法和應(yīng) 用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 一種腸道病毒71型3CD嵌合病毒，拉丁文學(xué)名：（Humanenterovirus713CD chimericvirus)，保藏單位名稱：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：湖北省武漢市 武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏日期：2015年6月24日，保藏編號(hào)：CCTCCNO.V201523。
[0011] 本發(fā)明病毒的形態(tài)特征描述：
[0012] 該病毒的顆粒為二十面體立體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜和突出，直徑約24~ 30nm，核酸為單股正鏈RNA。EV71型病毒基因組編碼的四種結(jié)構(gòu)蛋白VPl~VP4構(gòu)成原聚 體，后者再拼裝成具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位，60個(gè)亞單位通過(guò)各自的結(jié)構(gòu)域相互連接，最 終形成病毒的外殼。該病毒感染敏感細(xì)胞RD細(xì)胞后，形成的CPE特征為細(xì)胞變圓、固縮、折 光性增強(qiáng)，然后脫落。
[0013] 一種腸道病毒71型3⑶嵌合病毒的拯救方法，步驟如下：
[0014] (1)以SDLYl(GenBank，HM188481. 1)全長(zhǎng)cDNA為PCR模板，引物 1 (序列見(jiàn)表 2， SEQIDNo. 1)為上游引物，引物5 (序列見(jiàn)表2,SEQIDNo. 5)為下游引物擴(kuò)增3CD蛋白編 碼區(qū)；
[0015] (2)以SDLY107(GenBank，JX244186. 1)全長(zhǎng)cDNA為PCR模板，引物 6(序列見(jiàn)表 2，SEQIDNo. 6)為上游引物，引物4 (序列見(jiàn)表2,SEQIDNo. 4)為下游引物擴(kuò)增3'UTR編 碼區(qū)；
[0016] (3)采用融合PCR方法，以引物1，SEQIDNo. 1為上游引物，引物4,SEQIDNo. 4 為下游引物將兩個(gè)片段連接起來(lái)得到融合片段3CD(l)-3'UTR(107);
[0017] (4)將（3)中融合PCR產(chǎn)物3CD(l)-3'UTR(107)克隆連接入pMD19-T載體，形成 pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107);
[0018] (5)將pMD19-T-SDLY107 質(zhì)粒以及步驟⑷得到的pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107) 質(zhì)粒分別進(jìn)行HindIII和XbaI雙酶切，回收酶切片段后，利用T4連接酶進(jìn)行連接獲得重組 病毒質(zhì)粒口]\?19-1'-107(1-3〇));
[0019] (6)將步驟（5)得到的pMD19-T-107(l-3CD)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，并使用HindIII和 XbaI雙酶切，回收107 (1-3CD)，體外轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)染入RD細(xì)胞，37°C、5% 0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，傳代3次以上直至細(xì)胞病變穩(wěn)定即為腸道病毒71型3⑶嵌合病毒。
[0020]所述步驟（5)、（6)中酶切的具體步驟如下：HindIII與XbaIFastDigestenzyme 各2.5yL，質(zhì)粒（5中為pMD19-T-SDLY107質(zhì)粒和pMD19-T-3CD(l)-3'UTR(107)質(zhì)粒；6 中 為pMD19-T-107(l-3CD)質(zhì)粒）<2.5yg，10XFastDigestGreenBuffer5yL，水補(bǔ)齊至 50y1，37°C酶切3-4h。
[0021] 所述步驟（5)中具體為：將pMD19-T-107(l-3⑶）進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增后雙酶切得到 107 (1-3⑶)、體外轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染，RD細(xì)胞轉(zhuǎn)染RNA后，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以 期病毒的拯救，通過(guò)每日觀察細(xì)胞病變發(fā)現(xiàn)拯救病毒顆粒的出現(xiàn)，當(dāng)CPE達(dá)到90%病變時(shí)， 凍融一次（避免多次凍融）收獲上清即為第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接種細(xì)胞培 養(yǎng)板中（優(yōu)選取500y1接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中），放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)5天后未出現(xiàn)明顯的CPE，凍融一次（避免多次凍融），10,OOOg離心IOmin收獲上清，命 名為二代拯救病毒；繼續(xù)上述步驟接種二代病毒，約36h后出現(xiàn)病變，72h后病變達(dá)到90 %，凍融三次收獲病毒。反復(fù)操作傳代3次以上直至細(xì)胞病變穩(wěn)定即為拯救成功的病毒。
[0022] 上述腸道病毒71型3⑶嵌合病毒在制備疫苗中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024]EV71的3⑶作為一個(gè)前體蛋白在病毒的復(fù)制和致病中均發(fā)揮重要作用，因此嵌合 病毒株SDLY107 (1-3CD)的構(gòu)建為研究3CD編碼區(qū)在病毒致病機(jī)制中的作用、抗病毒藥物研 究和疫苗研制均提供了研究平臺(tái)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 一種腸道病毒71型3CD嵌合病毒，拉丁文學(xué)名：（Humanenterovirus713CD chimericvirus)，保藏單位名稱：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：武漢市武昌珞 珈山武漢大學(xué)，保藏日期：2015年6月24,保藏編號(hào)：CCTCCNO.V201523。
[0026] 圖1為pMD19-T-107全長(zhǎng)質(zhì)粒圖；
[0027] 圖2EV71全長(zhǎng)克隆pcDNA3.I(+)-SDLY107構(gòu)建模式示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029] 1材料與方法
[0030] I. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0031]I. I. 1細(xì)胞與病毒
[0032] 所用細(xì)胞為人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（rhabdomyosarcomacells，RD)。RD細(xì)胞生長(zhǎng) 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種病毒，待細(xì)胞病變至80%左右時(shí)，-40°C和室溫之間反復(fù)凍融三次后 4°C10, OOOg離心10分鐘收獲，儲(chǔ)存于_80°C冰箱中。
[0033]I. 1. 2實(shí)驗(yàn)試劑
[0034] 所用主要試劑為病毒RNA提取試劑盒（OMEGA,中國(guó)）、DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提 取試劑盒（0MEGA，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（T0Y0B0，日本）；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，美 國(guó)）；高效保真酶PrimeSTARGXLDNAPolymerase、pMD19_T(TaKaRa,中國(guó)）；限制性內(nèi)切 酶、轉(zhuǎn)染試劑（Thermo,美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)基、血清（HyClone，美國(guó)）；引物由上海生工生物工 程股份有限公司合成；測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)公司完成。
[0035]1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0036] L2. 1 擴(kuò)增EV71SDLY107 與SDLYl株病毒的cDNA
[0037] 使用OMEGA公司的ViralRNAkit試劑盒提取SDLY107與SDLYl株病毒的RNA，使 用T0Y0B0 公司的ReverTraAceqPCRKit逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。
[0038] 1. 2. 2引物設(shè)計(jì)與RCR擴(kuò)增
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