腸道病毒71型5’utr嵌合病毒及其拯救方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒及其拯救 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報道。1957年在新西 蘭首次報道，1958年首次分離出柯薩奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期發(fā)現(xiàn) 的手足口病的病原體主要為CoxA16型，手足口病與EV71感染有關(guān)的報道開始于20世紀(jì) 70年代初，1972年EV71首次在美國確認(rèn)。此后EV71感染與CoxA16感染交替出現(xiàn)，成為 手足口病的主要病原體。其多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù) 患兒可引起肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個別重癥患兒病情進(jìn)展較快，導(dǎo)致死亡。重 癥和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。
[0003] 腸道病毒71型?V71)屬于小RNA病毒科（Picornaradae)腸道病毒屬 (Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。EV71抗體在成人血清中的陽性率達(dá)到65% 以上，說明了這種病毒的廣泛傳播，每年春夏季溫度升高時都會進(jìn)入感染高峰期，流行趨勢 從散發(fā)逐漸趨于有小型聚集性爆發(fā)。
[0004] 手足口病的相關(guān)科研工作起步較晚，發(fā)達(dá)國家擁有較好的科研平臺，亞太地區(qū)為 主要流行區(qū)域，但對EV71的基礎(chǔ)研究投入不夠，至今在臨床上還沒有有效的疫苗和藥物， 對EV71進(jìn)行有效的預(yù)防和控制。由于腸道病毒71型屬于小RNA病毒科，所以其基因組的 人工操作較難，這給疫苗的制備增加了難度。
[0005] 因此目前對EV71的疫苗研究仍主要聚焦在傳統(tǒng)的滅活疫苗上，而此類疫苗的免 疫效果一般較低；雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生包括中和抗體在內(nèi)的免疫反應(yīng)，但不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時間較短，需要多次接種；需要使用佐劑，制劑中 存在滅活劑，滅活劑對病毒抗原有影響；由于誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平較低，以及各個抗原成分 之間的疫苗應(yīng)答不平衡，可能誘發(fā)疾病；一般不能通過自然途徑接種，不易產(chǎn)生局部免疫反 應(yīng)。由于以上問題的存在，亟需研發(fā)新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫應(yīng) 答，又能避免感染性。此類疫苗的研制，需要對病毒基因組中各基因編碼區(qū)域的功能進(jìn)行深 入研究和了解，這種深入了解還有助于篩選抗病毒藥物的靶點(diǎn)研究。
[0006] 反向遺傳學(xué)方法研究RNA病毒，是在質(zhì)粒水平上來操作、研究RNA病毒，獲得的拯 救病毒表型穩(wěn)定，操作方便，為EV71的深入研究提供了一個很好的基礎(chǔ)平臺。但迄今還沒 有合適的病毒作為疫苗研究的工具。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中沒有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技術(shù)偏見EV71的反向遺 傳學(xué)研究是無法實(shí)現(xiàn)的，此外由于EV71拯救病毒是一種新的病毒，所以在研究拯救方法時 就存在很大的不可預(yù)期性，如何克服這種不可預(yù)期性是現(xiàn)有技術(shù)中無法做到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是為了提供一種腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒及其拯救方法和 應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 一種腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒，拉丁文學(xué)名：（Humanenterovirus71 5'UTR chimericvirus)，保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：湖北省武漢市 武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏日期：2015年6月24日，保藏編號：CCTCCNO.V201524。
[0011] 本發(fā)明病毒的形態(tài)特征描述：
[0012] 該病毒的顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突出，直徑約24~ 30nm，核酸為單股正鏈RNA。EV71型病毒基因組編碼的四種結(jié)構(gòu)蛋白VPl~VP4構(gòu)成原聚 體，后者再拼裝成具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位，60個亞單位通過各自的結(jié)構(gòu)域相互連接，最 終形成病毒的外殼。
[0013] 一種腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒的構(gòu)建方法（模式圖見圖1)，步驟如下：
[0014] (1)以SDLYl(GenBank，HMl8848l. 1)全長cDNA為PCR模板，引物 5'UTR1F(序列 見表1，SEQIDNo. 1)為上游引物，引物5'UTRlR(序列見表1，SEQIDNo. 2)為下游引物 擴(kuò)增SDLYl株的5'UTR;
[0015]⑵以SDLYl〇7(GenBank，JXM4186. 1)全長cDNA為PCR模板，引物VP4 1〇7F(序 列見表1，SEQIDNo. 3)為上游引物，引物VP4 107R(序列見表1，SEQIDNo. 4)為下游引 物擴(kuò)增SDLY107的VP4;
[0016] (3)采用融合PCR方法，以5'UTR1F(SEQIDNo. 1)為上游引物，VP4 107R(SEQ IDNo. 4)為下游引物將兩個片段連接起來；
[0017] (4)步驟（3)得到得融合片段以及pcDNA3.I(+)-SDLY107質(zhì)粒（質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) 為本研究室保存，pcDNA3.I(+)-SDLY107構(gòu)建見下圖）進(jìn)行HindIII和BsiWI雙酶切，回收 酶切片段后，利用T4連接酶進(jìn)行連接獲得重組病毒質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)-107 (1-5'UTR);
[0018] (5)將步驟⑷得到的pcDNA3. 1⑴-107 (1-5'UTR)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄以及 RNA轉(zhuǎn)染。
[0019] 所述步驟（4)中酶切的具體步驟如下：HindIII與BsiWI FastDigest enzyme各 2. 5yL，DNA10yg，IOXFastDigest Green Buffer5yL，水補(bǔ)齊至 50yl，37°C酶切 3-4h。
[0020] 所述步驟（5)中具體為：RD細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組RNA后，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以 期病毒的拯救，通過每日觀察細(xì)胞病變發(fā)現(xiàn)拯救病毒顆粒的出現(xiàn)，當(dāng)CPE達(dá)到90%病變時， 凍融一次（避免多次凍融）收獲上清即為第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接種細(xì)胞培 養(yǎng)板中（優(yōu)選取500y1接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中），放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)3天后或出現(xiàn)明顯的CPE時同樣凍融一次（避免多次凍融），10,OOOg離心5min收獲 上清，即為低二代拯救病毒；繼續(xù)上述步驟接種二代病毒，約36h后出現(xiàn)病變，72h后病變達(dá) 到90%，凍融三次收獲病毒。反復(fù)操作傳代3次以上直至細(xì)胞病變穩(wěn)定即為拯救成功的病 毒。
[0021] pcDNA3.I(+) -SDLY107 質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：
[0022] 利用SDLY107株全基因組序列中固有的酶切位點(diǎn)（BsiWI，Bspl407I)，分三段擴(kuò)增 EV71全長基因組。構(gòu)建見圖2
[0023] (1)根據(jù)SDLY107株全長cDNA作為擴(kuò)增模板，以0RF107 F為上游引物（序列見 表1，SEQIDNo. 5)，以0RF107R為下游引物（序列見表1，SEQIDNo. 6)擴(kuò)增EV71的大 部開放閱讀框（BsiWI-Bspl407I)。將擴(kuò)增片段 0RF(BsiWI-Bspl407I)與pcDNA3. 1(+)質(zhì) 粒進(jìn)行HindIII與XbaI雙酶切。酶切片段回收后，進(jìn)行T4連接獲得pcDNA3.I(+)-ORF(Bs iWI-Bspl407I)。
[0024] (2)以SDLY107株全長cDNA為擴(kuò)增模板，5 ^UTR107F(含有T7啟動子）為 上游引物（序列見表1，SEQIDNo. 7)，VP4 107R為下游引物（序列見表1，SEQID No. 4)擴(kuò)增EV71的5 '端（5 'UTR-BsiWI)。將擴(kuò)增片段5 'UTR-BsiWI以及載體 pcDNA3.l(+)-0RF(BsiWI-Bspl407I)進(jìn)行HindIII以及BsiWI酶切。酶切片段回收后，進(jìn)行 T4 連接獲得pcDNA3.I(+)-5'UTR-ORF(BsiWI-Bspl407I)。
[0025] (3)以3'UTRBspl407IF為上游引物（序列見表 1，SEQIDNo.8)，3'UTR52TR 為下游引物（序列見表1，SEQIDNo.9)擴(kuò)增EV71的3'端（Bspl407I-3'UTR)。將擴(kuò)增片 段Bspl407I-3'UTR以及載體pcDNA3. 1(+)-5'UTR-ORF(BsiWI-Bspl407I)進(jìn)行Bspl407I 以及XbaI酶切。酶切片段回收后，進(jìn)行T4連接獲得全長EV71克隆pcDNA3.l(+)-SDLY107。
[0026] 表1:引物序列
[0029]上述腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒在制備疫苗中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] 非編碼區(qū)的研究一直存在一個瓶頸問題，就是它無法像編碼區(qū)的研究一樣，可以 通過構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的蛋白進(jìn)行研究。反向遺傳技術(shù)為非編碼區(qū)的研究提供 了新的思路，我們構(gòu)建的EV71的5'UTR區(qū)的嵌合毒株為研究EV71的5'UTR區(qū)在致病機(jī)制 中的作用提供了研究平臺。
【附圖說明】
[0032] 一種腸道病毒71型5'UTR嵌合病毒，拉丁文學(xué)名