一種海洋微生物菌株Y112及其產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及海洋微生物領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種海洋微生物菌株Y112及其產(chǎn)的 a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精（cyclodextrin，縮寫CD)是由a-1, 4-糖巧鍵相連而成的，環(huán)狀的，無還原 端的麥芽低聚糖。環(huán)糊精通常由6、7或8個(gè)葡萄糖殘基組成，分別被稱為a-、e-、或丫-環(huán) 糊精。除了運(yùn)S種常用的環(huán)糊精外，還有5-、e-、C-和n-環(huán)糊精（分別由9~12個(gè)葡 萄糖單元組成）。環(huán)糊精具有能夠?qū)⒍喾N化學(xué)物質(zhì)全部或部分封裝入空腔內(nèi)的能力，從而改 變了運(yùn)些化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)。環(huán)糊精是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CG化Se)作用于 淀粉轉(zhuǎn)化而成，主要產(chǎn)物為a-、0-、丫-環(huán)糊精的混合物。由于環(huán)糊精分離提純工藝非常 復(fù)雜，因此尋找能催化產(chǎn)生特定環(huán)糊精的CG化Se的產(chǎn)生菌非常重要。目前，研究報(bào)道主要 集中在0-CG化Se產(chǎn)生菌株上，而有關(guān)a-、丫-CG化Se產(chǎn)生菌的研究報(bào)道卻很少。幾乎很少 有主要產(chǎn)Q-或丫-環(huán)糊精的CG化Se報(bào)道?？莶菅勘U菌BacillussubtilisNo. 313、嗜堿 芽抱桿菌Bacillusstrain290-3、芽抱桿菌Bacillussp.Ak6 和短桿菌Rrevibacterium sp.No9605是目前已知的產(chǎn)丫-CG化Se的菌株。
[0003] 目前環(huán)糊精的制備主要是采用酶法合成的，而酶法制備會(huì)產(chǎn)生多種環(huán)糊精的混合 物，不利于生產(chǎn)單一環(huán)糊精及分離純化，運(yùn)極大限制了環(huán)糊精的應(yīng)用。因此，尋求一種能夠 生產(chǎn)特定單一a-環(huán)糊精Q--CG化Se的生產(chǎn)菌，克服目前酶法制備產(chǎn)生多種環(huán)糊精混合 物，降低環(huán)糊精生產(chǎn)成本，成為當(dāng)今世界開發(fā)產(chǎn)酶菌，促進(jìn)環(huán)糊精在醫(yī)藥、食品、化工、化 妝品、工業(yè)和農(nóng)業(yè)W及分析化學(xué)等方面得到廣泛的應(yīng)用關(guān)注的焦點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)酶法產(chǎn)生多種環(huán)糊精的混合物的不足，經(jīng)發(fā)明 人長期開發(fā)研究海洋微生物及其酶產(chǎn)物和生產(chǎn)實(shí)踐，開發(fā)提供一種產(chǎn)單一a-環(huán)糊精葡萄 糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株Y112及其產(chǎn)的a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0005] 本發(fā)明提供一種產(chǎn)單一a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株Y112(簡稱 菌株Y112)來自黃海海域，將得到的序列用GenBank中的BLAST進(jìn)行比對分析。測序得到 長度約1420bp左右的16SrDNA序列，堿基組成如圖1。采用Nei曲bor-化ining方法構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2,結(jié)果表明菌株Y112與Bacillus屬成員具有較高的序列相似性，因此屬 于芽抱桿菌屬。同時(shí)菌株Y112與Bacillusagara化aerensDSM8721的同源性達(dá)100%，說 明菌株Y112與DSM8721親緣性很近。經(jīng)過16SrDNA序列分析結(jié)合其生理生化特征，該菌 株被鑒定為芽抱桿菌屬度acillusSP.)。該產(chǎn)〇-〔6化36的海洋微生物菌株￥112于2015 年7月13日保藏于中國武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCCNO: M2015447。
[0006] 海洋微生物菌株Yl12的形態(tài)和生理生化特征：
[0007] 菌株Yl12的形態(tài)特征：
[0008] 菌株Y112為不規(guī)則短桿狀，革蘭氏陽性，菌落在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形，乳白色， 表面平坦、邊緣不整齊。
[0009] 菌株Yl12生理生化特征：
[0010] 菌株Y112能在抑8. 0-11.0的條件下生長，最適生長抑為10 ;生長的溫度范圍為 10-45°C，最適生長溫度33°C;最高能耐受16wt%的化Cl,在含有5%Wt化Cl條件下生長量 最高。菌株Y112能夠分解淀粉、明膠、Tween40或Tween60,不能分解Tween20。氧化酶、 過氧化酶或硝酸鹽還原結(jié)果為陽性，硫化氨、嗎I噪產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果為陰性。菌株Y112還能夠 利用精氨酸、巧樣酸、尿素或薦糖，不能利用賴氨酸、鳥氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、 鼠李醇或阿拉伯糖。 W11] 菌株Y112-16SrDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析：
[0012] 對菌株Y112的16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序得到長度約1420bp左右的16S rDNA序列，堿基組成如圖1。
[0013] 一、產(chǎn)a-CG化Se的海洋微生物菌株Y112的選育與鑒定：
[0014] 1、粗酶液的制備
[0015] 在裝種子培養(yǎng)基液30mL的S角瓶中接種海洋微生物菌株Y112后，30°C、200r/min 下活化22h，W4% (V/V)的接種量接種至裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的S角瓶中，27°C、230r/ min培養(yǎng)50h，收集發(fā)酵液在1000 Og的離屯、力條件下離屯、15min，上清為粗酶液。所述種子培 養(yǎng)基的組成：每升培養(yǎng)基含可溶性淀粉lOg，蛋白腺5g，酵母浸粉5g，KzHPOJg,M拆〇4?7&0 0. 15g，化Cl50g，121°C滅菌20min。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：每升培養(yǎng)基含玉米淀粉lOg， 蛋白腺5g，酵母浸粉5g，KzHPOJg，MgS〇4 ?%0 0. 15g，化Cl50g混合均勻，121°C滅菌 20min ;
[0016] 本發(fā)明中酶活的測定采用甲基澄稱色法。該酶活單位定義為上述條件下生成 1yga-環(huán)糊精所需的酶量
[0017] 生物量的測定：采用比濁法測定生物量。
[0018] 2、a -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的選育
[0019] 1)、產(chǎn)CGhse的菌株篩選：
[0020] 在堿性的瓊脂培養(yǎng)基上添加0. 03% (w/v)酪獻(xiàn)和0. 01% (w/v)甲基澄作為活性 篩選平板，將活化后的能夠產(chǎn)淀粉水解酶的海洋微生物，稀釋涂布于發(fā)酵復(fù)篩活性篩選平 板上，30°C觀察培養(yǎng)60h。在產(chǎn)CG化Se的菌株形成黃色透明的水解圈。運(yùn)是由于菌株所產(chǎn) 的CG化Se能夠降解培養(yǎng)基中的可溶性淀粉形成環(huán)糊精，后者能夠包埋甲基澄或酪獻(xiàn)，使其 呈現(xiàn)黃色。此圈越大，菌株產(chǎn)的CG化Se越多，選取透明圈與菌落直徑比值較大的單菌落，接 種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定其發(fā)酵液的a-CG化Se活力。從中篩選出酶活 較高者，利用亞硝基脈和利福平復(fù)合誘變篩選優(yōu)良菌種，誘變后利用上述同樣的方法進(jìn)行 初篩和復(fù)篩，最終選取出酶活最高且遺傳穩(wěn)定的菌株112,作為后續(xù)誘變的出發(fā)菌株。
[0021] 2)、菌株Y112生長曲線： 陽02引配制14組液體種子培養(yǎng)基（250血小瓶裝液量30血)，平行接種后在30°C環(huán)境下 培養(yǎng)2她，接種后每隔化，取一組測培養(yǎng)基的生物量。
[0023] W稀釋后樣品的OD值對培養(yǎng)時(shí)間作圖，得菌株Y112生長曲線，由此可見，接種后 14-24h為對數(shù)增長期。
[0024] 3)、亞硝基脈（利福平）誘變：
[00巧]液體種子培養(yǎng)基（250mL小瓶裝液量30mL)接種后培養(yǎng)至對數(shù)期。在無菌條件下， 將種子液轉(zhuǎn)入無菌離屯、管中，4000g的離屯、力下離屯、lOmin，去除上清收集菌體。無菌條件 下，根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)法測定的結(jié)果加入適量緩沖液（pH9. 0, 0.Imol/L甘氨酸-NaOH緩 沖液）將菌懸液制成約1〇8個(gè)/mL,然后加入玻璃珠將細(xì)菌沉淀打勻；在無菌條件下，向細(xì) 菌懸浮液中加入不同劑量的亞硝基脈（或利福平），搖勻后蓋上紗布，30°C，200r/min，培養(yǎng) 30min，60min。經(jīng)亞硝基脈處理的菌懸浮液，W4000g的離屯、力離屯、lOmin，棄去上清液，再 加入憐酸緩沖液洗涂一次，并在同樣條件下離屯、，棄去上清液。最后加入與處理時(shí)相同體積 的無菌生理鹽水，再用無菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布于平板上。30°C培養(yǎng)2d左右，計(jì)算 致死率。 陽0%] 采用亞硝基脈和利福平復(fù)合誘變篩選優(yōu)良菌種，選取致死率為95 %的劑量處理對 數(shù)期的菌懸液，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終獲得突變株Y112酶活最高，為出發(fā)菌株的1. 37倍。同 時(shí)，菌株Yl12在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)接種4代，產(chǎn)酶