一種篩選產(chǎn)微生物塑料菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物菌株篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于單細(xì)胞拉曼光譜篩選產(chǎn)微生物塑料菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]塑料制品在人類的日常生活和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要的地位，以合成樹脂為主的普通塑料由于難以降解已經(jīng)造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題，研宄和開發(fā)新的可降解生物塑料迫在眉睫。在眾多的生物可降解材料中，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的微生物塑料一一多聚β -羥基烷酸酯(PHA)不僅具有普通高分子材料的力學(xué)性能和加工性能，還具有可生物降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性等普通高分子材料無(wú)法比擬的特性。PHA在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，因而成為研宄熱點(diǎn)，其中聚β-羥基丁酸(PHB)是研宄和應(yīng)用最廣泛的一種多聚體。PHA作為細(xì)胞內(nèi)同化作用的初級(jí)產(chǎn)物，是微生物遇到不適環(huán)境時(shí)在胞內(nèi)累積合成的一種脂類儲(chǔ)藏物質(zhì)，可以作為胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量的儲(chǔ)存物質(zhì)參加細(xì)胞代謝。
[0003]當(dāng)前PHA的合成途徑主要通過微生物發(fā)酵法獲得，而影響PHA進(jìn)一步商業(yè)化和廣泛推廣的阻力是其發(fā)酵底物價(jià)格較高，發(fā)酵、提取過程能耗大，生產(chǎn)成本高。而優(yōu)良菌株是影響發(fā)酵效率、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過創(chuàng)新的技術(shù)，快速篩選能利用廉價(jià)的底物進(jìn)行發(fā)酵的高產(chǎn)PHA菌株，是加快生物塑料產(chǎn)業(yè)化的有效途徑之一。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過300多種菌種能夠合成生物塑料，人們?nèi)匀辉趯ふ腋鼮槔硐氲暮铣缮锼芰系木N。
[0004]染色法是目前最常用的篩選產(chǎn)PHA微生物的方法，主要包括蘇丹黑玻片染色法、尼羅藍(lán)玻片染色法和尼羅藍(lán)菌落染色法等。這些方法均需要通過染色來(lái)確認(rèn)細(xì)胞所含聚酯物質(zhì)為ΡΗΑ，操作過程復(fù)雜，且耗時(shí)較多。更具體的，蘇丹黑玻片染色法對(duì)PHA的專一性差、操作方法繁瑣，不是理想的篩選方法；尼羅藍(lán)染色法專一性強(qiáng)，操作相對(duì)比蘇丹黑玻片染色法簡(jiǎn)便快速，但是尼羅藍(lán)玻片染色法需要細(xì)胞固定、染色；尼羅藍(lán)菌落染色法是染色法中操作最為簡(jiǎn)便的一種方法，但是需要針對(duì)不同的微生物選用適當(dāng)?shù)娜旧簼舛龋@對(duì)大量未知微生物的篩選來(lái)說是難以確定的，而且添加到培養(yǎng)基的尼羅藍(lán)染料和其它試劑給待選菌株帶來(lái)未知的傷害，不能用于直接篩選。
[0005]參考文獻(xiàn):
1、薛林貴，趙旭，景春娥，常思靜.尼羅藍(lán)在篩選PHB高產(chǎn)菌株中的應(yīng)用研宄生物技術(shù)通報(bào)，2010，212(3): 181-184
2、季愛云，崔志芳，李春露，劉娜山.生物可降解塑料聚羥基丁酸酯產(chǎn)生菌的選育.塑料，2010，39(3): 100-102.3、薛林貴，常思靜，趙旭，景春娥.PHB高產(chǎn)菌株選育中初篩方法的比較研宄.應(yīng)用化工，2010，39(5): 633-636
4、Degelau A, Scheper Tj Bailey J Ej Guske C.Fluorometric measurementof poly-beta hydroxybutyrate in Alcaligenes eutrophus by flow cytometryand spectrofluorometry.Applied Microb1logy & B1technology, 1995， 42(5):653-657.5、孫燕飛，王猻，程模香，雷勇輝，熊杰.一種快速篩選產(chǎn)聚羥基烷酸細(xì)菌方法的建立.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40(4): 87-89ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]目前，篩選微生物塑料高產(chǎn)菌株所采用的染色法靈敏度較差，操作過程繁瑣，很大程度上限制了 PHA高產(chǎn)菌株的篩選。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種無(wú)需染色、操作簡(jiǎn)便、可靠，且能夠快速直觀篩選出產(chǎn)PHA菌株的方法。
[0007]具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種篩選產(chǎn)微生物塑料菌株的方法，包括以下步驟:
(1)將含菌樣品與無(wú)菌水混勻，進(jìn)行KT1?10_5梯度稀釋，吸取少量含菌水涂布在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)成菌落；
(2)選擇生長(zhǎng)迅速、特征典型的菌落，挑取少量待檢樣品懸浮于無(wú)菌水中；
(3)采用激光鑷子將單個(gè)待檢樣品細(xì)胞固定，并通過拉曼光譜儀采集拉曼光譜；
(4)通過拉曼光譜特征峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)待檢樣品細(xì)胞產(chǎn)PHA的判別。
[0008]激光鑷子，又稱光學(xué)鑷子(英文:Optical tweezer)，就是用激光形成的鑷子，是一種利用光壓原理制造的能夠移動(dòng)或固定單個(gè)細(xì)胞和其他微小物體的儀器。拉曼光譜儀由激光源、收集系統(tǒng)、分光系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成，激光源一般采用能量集中、功率密度高的激光，收集系統(tǒng)由透鏡組構(gòu)成，分光系統(tǒng)采用光柵或陷波濾光片結(jié)合光柵以濾除瑞利散射和雜散光以及分光檢測(cè)系統(tǒng)采用光電倍增管檢測(cè)器、半導(dǎo)體陣檢測(cè)器或多通道的電荷藕合器件。通過拉曼光譜技術(shù)能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、無(wú)損傷的定性定量分析。
[0009]本發(fā)明方法中，通過激光鑷子將單個(gè)待檢樣品細(xì)胞移動(dòng)并固定在光束的聚集中心，采集到的拉曼光譜是整個(gè)細(xì)胞的完整信號(hào)，比常規(guī)的共焦顯微方法得到更強(qiáng)的信號(hào)，更好的信噪比。而且，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，PHA的拉曼光譜特征峰強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)PHA的含量，間接反應(yīng)了細(xì)胞的產(chǎn)PHA能力。因此，通過對(duì)待檢樣品細(xì)胞產(chǎn)PHA的拉曼光譜的采集與分析，便能快速直觀地判斷出待檢樣品細(xì)胞是否具備產(chǎn)PHA的能力，以及產(chǎn)PHA能力的大小，從中確定高產(chǎn)PHA的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行分離、純化。
[0010]作為本發(fā)明方法的進(jìn)一步說明，所述篩選培養(yǎng)基至少含有以下組分=Na2HPO4.12H2O 9.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4.7H20 0.2 g/L，CaCl2.2H20 0.02 g/L，NaHCO3 0.5 g/L，F(xiàn)eCl3 0.08 g/L, (MM)2SO4 4.0 g/L，微量元素溶液 I mL，葡萄糖 50 g/L。
[0011]作為本發(fā)明方法的進(jìn)一步說明，所述微量元素溶液至少含有以下組分:CoC12.6H20
0.2 g/L, ZnSO4.7H20 0.1 g/L, MnCl2.4H20 30 mg/L，NaMoO4.2H20 30 mg/L，NiCl2.6H2020 mg/L, CuSO4.5H20 10 mg/L, FeSO4.7H20 20 mg/L, H3BO3 0.3 g/L。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需染色，直接在無(wú)菌水中進(jìn)行檢測(cè)即可。
[0013](2)本發(fā)明方法能夠快速直觀地篩選出產(chǎn)PHA菌株，每個(gè)樣品細(xì)胞進(jìn)行光譜采集、數(shù)據(jù)處理等工序僅需要10?20 S，每個(gè)樣品5 min即可。
[0014](3)本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)細(xì)胞不造成傷害，而且適用于所有單細(xì)胞微生物，檢測(cè)后的樣品不影響進(jìn)一步的分離和純化。
【附圖說明】
[0015]附圖1是菌落細(xì)胞拉曼光譜與搖瓶發(fā)酵PHB產(chǎn)量相關(guān)性分析圖。
[0016]附圖2是不同菌株間單個(gè)細(xì)胞PHB特征峰平均強(qiáng)度對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，本實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明作更清楚的說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018]一、菌落細(xì)胞拉曼光譜與搖瓶發(fā)酵PHB產(chǎn)量相關(guān)性分析
1、實(shí)驗(yàn)材料