為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，對其表達(dá)量進(jìn)行分析，下面是 對本發(fā)明做的進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是僅是對本發(fā)明的解釋不是限定。
[0044] 2. 1乳腺組織RNA的提取
[0045] 將在液氮中儲(chǔ)存的3頭高乳脂及3頭低乳脂的中國荷斯坦奶牛的乳腺組織取出， 研磨成粉末狀利用Trizol法進(jìn)行組織RNA提取。
[0046] 1)裂解：EP管中加入裂解液（Trizol) 1ml，將研磨好的組織粉末分別加入EP管 中，加入離心管中室溫下裂解5Min ;
[0047] 2)分層：向離心管中加入0.2ml的氯仿，顛倒混勾，15~30°C靜置lOmin，再用4°C 大離心機(jī)進(jìn)行離心，12000r離心15Min(DNA和蛋白質(zhì)被抽提進(jìn)入有機(jī)相，RNA留在水相）；
[0048] 3)沉淀：吸上清置新的離心管中，加0.5ml的異丙醇充分混勻后15~30°C靜置 lOmin，在 4°C，12000r 離心 13Min，棄上清；
[0049]4)洗滌：加入1ml 75%的冷乙醇，輕輕洗滌沉淀，短暫震蕩混勻，在4°C，12000r離 心5Min，棄上清；
[0050] 5)干燥：室溫空氣干燥RNA沉淀至半透明，約lOMin，不要讓RNA干透；
[0051] 6)溶解：加入適量的DEPC0. 02ML處理水溶解，分裝-80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0052] 將獲得的RNA分裝，電泳檢測后，結(jié)果如圖1所示。用分光光度計(jì)測總RNA的濃度， 調(diào)整濃度統(tǒng)一后，于-80 °C的冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>[0053] 2. 2采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的組織RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA樣品。
[0054] 建立的反轉(zhuǎn)錄體系如下表2所示。反轉(zhuǎn)錄條件為：70 °C 5min;冰浴2min; 42°C 60min ;75°C 15min ;冰浴10min。所得產(chǎn)物儲(chǔ)存于-80°C冰箱中備用。
[0055] 表2?建立的反轉(zhuǎn)錄體系
[0056]
[0057] 2. 3 C4BPA基因的引物設(shè)計(jì)，根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫（ENSBTAT00000050299)提供的 牛C4BPA基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物技術(shù)有限 公司合成。
[0058]引物序列如下：C4BPA-F5' -AGATACACCTGTCGTCCTGGC-3'，C4BPA-R5'-TCTGTCTTAAC TATCACTTGCCCA-3'，將所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增的片段大小與目的基因的大小相符，無雜帶，條帶清晰，沒 有二聚體，表明所設(shè)計(jì)的引物可以用于后續(xù)的熒光定量PCR試驗(yàn)。
[0059] 2. 4實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系和條件。
[0060] 以所提取的奶牛乳腺組織的cDNA為模板（3個(gè)樣品重復(fù)）進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng) 體系如下表3所示。反應(yīng)條件為：95°C 30s，95°C 5s，60°C 30s，40個(gè)循壞。
[0061] 表3實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系
[0062]
[0063] 3.篩查獲得的C4BPA基因在小問中國荷斯坦奶午乳腺組織中的表達(dá)量差異分析 及應(yīng)用
[0064] 為了確定C4BPA基因在不同奶牛乳腺組織中均有表達(dá)且表達(dá)量差異顯著 (P〈0. 05)，與中國荷斯坦奶牛的乳脂代謝的相關(guān)性，采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法進(jìn)行相關(guān)性 的檢測，采用SPSS13. 0的ONE-WAY AN0VA的方法分析C4BPA基因?qū)χ袊伤固鼓膛Ｈ橹?謝的相關(guān)性。
[0065] 應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測查C4BPA基因與中國荷斯坦奶牛乳脂代謝的相關(guān)性研 究，通過對篩選出的3頭高脂高蛋白奶牛和3頭低脂低蛋白奶牛乳腺組織RNA的提取，反轉(zhuǎn) 錄成cDNA，并以之為模板，設(shè)計(jì)熒光定量引物，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到6頭奶牛的乳 腺組織中的表達(dá)量的CT值，采用的是2- A ACT方法計(jì)算6頭奶牛的乳腺組織C4BPA基因的表 達(dá)量，以檢測C4BPA基因的表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，C4BPA基因在 不同奶牛的乳腺組織的表達(dá)量如下表4所示。對于C4BPA基因在不同奶牛的乳腺組織中的 表達(dá)情況，C4BPA基因在不同奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量差異分析，在各組樣品中觀察溶解 曲線，反應(yīng)的溶解曲線如圖3和圖4所示，峰值單一說明特異性良好，各個(gè)峰值基本一致，未 見其雜峰信號，PCR參數(shù)選擇合理，產(chǎn)物的特異性較好，非特異性產(chǎn)物對試驗(yàn)結(jié)果的影響較 小，結(jié)果可信。
[0066] 表4C4BPA基因在不同奶牛的乳腺組織的表達(dá)差異分析
[0067]
[0068] 注：表達(dá)量EX= 2AAct
[0069] 4.本發(fā)明制備的一種與中國荷斯坦奶牛乳脂代謝相關(guān)的C4BPA基因的定量PCR檢 測技術(shù)在中國荷斯坦奶牛牛群體中應(yīng)用：
[0070] 4. 1C4BPA基因在奶牛乳腺組織中表達(dá)量的相關(guān)性分析；
[0071] C4BPA基因在所檢測的6個(gè)不同的乳腺組織中均有表達(dá)，且在高乳脂奶牛中的表 達(dá)量顯著低于低乳脂奶牛（P = 〇. 〇26〈0. 05)。表明C4BPA基因與中國荷斯坦奶牛的乳脂代 謝顯著相關(guān)，可進(jìn)一步為遺傳育種工作者構(gòu)建低脂奶牛或高脂奶牛的育種工作奠定基礎(chǔ)， 滿足對不同人群的不同需求。
[0072] 為進(jìn)一步研究該基因及探討可能影響中國荷斯坦奶牛乳脂的基因提供依據(jù)和可 靠的研究方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定量PCR檢測方法，其方法如下所述： 第一步、設(shè)計(jì)特異性的定量引物，得到的引物序列如下所示： C4BPA 正向引物 F :5' AGATACACCTGTCGTCCTGGC 3' C4BPA 反向引物 R :5' TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA 3' 用所示的特異性定量引物在奶牛的基因組中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測； 第二步、乳腺組織RNA的提?。? 取高乳脂和低乳脂奶牛的乳腺組織，利用Trizol法進(jìn)行組織RNA提取，經(jīng)過裂解、分 層、沉淀、洗滌、干燥及溶解的步驟，將獲得的RNA進(jìn)行分裝，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后， 用分光光度計(jì)測總RNA的濃度，調(diào)整濃度統(tǒng)一后，于-80°C的冰箱凍存?zhèn)溆茫? 第三步、將乳腺組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA : 將提取的總RNA調(diào)整濃度統(tǒng)一后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的組織RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 樣品，總 RNA 的反轉(zhuǎn)錄體系：5 X RNA RT Buffer 4. Oyl ;dNTP Mixture IOmm 2. Oyl ; 01ig〇-dT I.0 yI ；AMV Reverse TranscriptaseO. 5 yI；RNase inhibitor 0.5 yI ；Total RNA 1.0yl;RNase Free H207.0 yl，反轉(zhuǎn)錄條件為：70°C5min;冰浴 2min;42°C60min; 75°C 15min ;冰浴lOmin，所得產(chǎn)物儲(chǔ)存于-80°C冰箱中備用； 第四步、進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)： 進(jìn)行熒光定量？〇?時(shí)的反應(yīng)體系20111，包括2\3￥81?11^，10^1;〇0嫩模板，1.(^1 ; CldH2O 8yl ;上下游引物各0. 5yl，反應(yīng)條件為：95°C 30s ;95°C 5s，60°C 30s，40個(gè)循環(huán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定量PCR檢測方法，其特征 在于：所述的第二步中裂解、分層、沉淀、洗滌、干燥及溶解的具體步驟如下： 裂解：加入裂解液Trizol Iml，將研磨好的組織粉末分別加入EP管中，室溫下裂解 5Min ； 分層：加入0. 2ml的氯仿，顛倒混勻，15~30°C靜置lOmin，再用4°C大離心機(jī)進(jìn)行離 心，12000r 離心 15Min ; 沉淀：吸上清置新的離心管中，加0. 5ml的異丙醇充分混勻后15~30°C靜置lOmin， 在4°C的低溫離心機(jī)以12000r離心13Min，棄上清； 洗滌：加入1ml 75 %的冷乙醇，輕輕洗滌沉淀，短暫震蕩混勻，在4°C，12000r離心 5Min，棄上清； 干燥：室溫空氣干燥IOMin RNA沉淀至半透明； 溶解：加入適量的DEPC 0. 02ML處理水溶解，最后將獲得的RNA進(jìn)行分裝。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定量PCR檢測方法，其方法為：第一步、設(shè)計(jì)特異性的定量引物；第二步、乳腺組織RNA的提?。坏谌?、將乳腺組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；第四步、進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。有益效果：提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高、便于在基因組水平上篩查和檢測C4BPA基因與奶牛乳脂代謝的相關(guān)性的定量PCR方法。為進(jìn)一步研究該基因及探討可能影響奶牛乳脂的基因提供了依據(jù)及可靠的研究方法。本發(fā)明篩查獲得C4BPA基因與奶牛乳脂代謝相關(guān)，可用于奶牛的育種工作，以便滿足不同人群對牛奶中乳脂含量的要求。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105063232
【申請?zhí)枴緾N201510593430
【發(fā)明人】蘆春艷, 趙志輝, 楊潤軍, 姜平, 房希碧, 龍小娟, 肖航
【申請人】吉林大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月17日