一種熒光定量pcr檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法，包括熒光定量PCRMIX試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因blaTEM引物；所述的16sRNA通用引物包括16sRNA通用引物1：5'?CGTATCGGTCGCATTGTT?3'，16sRNA通用引物2：5'?CTTCGTCCCATTTCAGGTT?3'；所述的耐藥基因blaTEM引物包括耐藥基因blaTEM引物1：5'?CGGTATTATCCCGTGTTG?3'；耐藥基因blaTEM引物2：5'?GTCGTTTGGTATGGCTTC?3'。本發(fā)明提供的試劑盒材料完整、操作簡單，具有快速、較高的靈敏度、良好的特異性，對獲取養(yǎng)殖場環(huán)境中耐藥基因信息具有廣泛的適用性。
【專利說明】
一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及 其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細菌耐藥基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸 桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素的使用存在諸多不規(guī)范的情況，臨床和畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗 生素的不合理使用導(dǎo)致微生物在選擇性壓力作用下獲得并維持耐藥性，且有可能通過質(zhì)粒 和整合子將耐藥基因在相同或不同種屬中廣泛傳播轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致多重耐藥。耐藥基因在 養(yǎng)禽場中從發(fā)病動物體內(nèi)的耐藥菌株傳遞給環(huán)境中的非致病菌，非致病菌在養(yǎng)殖場中不能 被完全消滅，致使耐藥基因在舍內(nèi)長期存在，不斷地傳遞給可能出現(xiàn)的致病菌，從而使得養(yǎng) 殖場細菌病治療難度加大。目前，在研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，耐藥基因檢測多為致病菌耐藥基因、 對單種細菌耐藥基因的檢測，且多采用普通PCR技術(shù)，在靈敏度、快速性和廣泛性等方面存 在不足。
[0003] 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒 光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量、通過內(nèi)參或外參法對待測樣 品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。具有快速高效、靈敏度高、特異性強等特點。經(jīng)過 對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)有利用實時熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥 基因的方法，因此開發(fā)熒光實時定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥基因的試劑盒十 分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測 方法，解決了目前沒有利用實時熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥基因的方法 的問題。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒，包括熒光定量PCR MIX 試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 b laTEM引物；
[0007] 所述的16sRNA通用引物包括
[0008] 16sRNA通用引物1:5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'（SEQ ID N0:1)，
[0009] 16sRNA通用引物2:5'-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3'（SEQ ID N0:2);
[0010] 所述的耐藥基因 blaTEM引物包括
[0011] 耐藥基因 blaTEM引物 1:5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'（SEQ ID N0:3);
[0012] 耐藥基因 blaTEM引物2:5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'（SEQ ID N0:4)。
[0013] 進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為：所述的16sRNA通用引物的濃度為0.1~0.5μ mol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度為0 · 1~0 · 5ymol/L。
[0014] 進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量 分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶;濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。
[0015] 本發(fā)明的所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒的用 途:用于對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性進行定量檢測。
[0016] 進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的β-內(nèi)酰胺類藥物為頭孢菌素。
[0017] 本發(fā)明也提供了一種養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測方法，利用本發(fā)明的所述的試劑盒， 包括以下步驟：
[0018] (1)采集環(huán)境細菌檢測樣品。
[0019] (2)提取環(huán)境中細菌基因組RNA;
[0020] (3)將步驟(2)所得的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0021] (4)將步驟(3)得到的cDNA加入到熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測試劑 盒，混勻，進行PCR擴增；
[0022] (5)PCR擴增結(jié)束后，根據(jù)熒光實時定量PCR儀對結(jié)果進行分析，根據(jù)耐藥基因 blaTEM和16sRNA基因的Ct值，通過相對Ct法計算耐藥基因 mRNA的相對表達量，即為耐藥基 因表達的信息。
[0023] 進一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的PCR擴增的條件為PCR擴增時預(yù)孵育95 。(：，時間5min;變性溫度為95°C，反應(yīng)時間為10s;擴增溫度72°C，時間30s;循環(huán)數(shù)為45。 [0024]本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明提供的試劑盒材料完整、操作簡單，具有快速、較高的靈敏度、良好的特異 性，對獲取養(yǎng)殖場環(huán)境中耐藥基因信息具有廣泛的適用性。
[0026] 本發(fā)明提供的試試劑盒可以對養(yǎng)殖場環(huán)境細菌相關(guān)耐藥基因進行定量，從而為養(yǎng) 殖場常見細菌病的藥物治療和獸藥廠藥物生產(chǎn)提供指導(dǎo)。
[0027] 本發(fā)明提供的檢測方法反應(yīng)條件溫和，擴增快速高效，lh左右即可完成，不需要電 泳，與普通PCR相比更快速、靈敏，而且沒有污染。
【附圖說明】
[0028] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0029]圖1為耐藥基因 blaTEM基因熔解曲線；
[0030]圖2為不同菌株大腸桿菌blaTEM基因檢測結(jié)果；
[0031]圖3為不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結(jié)果；
[0032]圖4為腸道桿菌科不同細菌blaTEM基因檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0033]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0034] 實施例1
[0035] -種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒，包括熒光定量PCR MIX 試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 b laTEM引物；
[0036] 所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶； 濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。
[0037] 所述的16sRNA通用引物包括
[0038] 16sRNA通用引物1:5，-CGTATCGGTCGCATTGTT-3，（SEQ ID N0:1)，
[0039] 16sRNA通用引物2:5，-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3，（SEQ ID N0:2);
[0040] 所述的耐藥基因 blaTEM引物包括
[0041] 耐藥基因 blaTEM引物1:5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'（SEQ ID N0:3);
[0042] 耐藥基因 blaTEM引物2:5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'（SEQ ID N0:4)。
[0043] 16sRNA通用引物的濃度為0.5ymol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度為0.5ymol/L， 所述的熒光定量PCR MIX試劑采用上述試劑。熒光定量PCR MIX試劑也可以采用市場上的其 它試劑。
[0044] 實施例2
[0045]與實施例1基本相同，不同之處在于：16sRNA通用引物的濃度為O.lymol/L;耐藥基 因 blaTEM引物的濃度為0.3ymol/L。
[0046] 實施例3
[0047]與實施例1基本相同，不同之處在于：16sRNA通用引物的濃度為0.2ymol/L;耐藥基 因 blaTEM引物的濃度為0.1ymol/L。
[0048] 實施例4
[0049] -種養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測方法，包括以下步驟：
[0050] (1)采集環(huán)境細菌檢測樣品：地面采樣，采樣點采用梅花式(7點法)分布，用5cmX 5cm無菌規(guī)格板，放在地面，采樣面積100cm2，用中和劑浸潤后的滅菌棉拭子一個，在規(guī)格板 內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉(zhuǎn)棉拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子頭部放入10ml 含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫無菌洗脫液試管中，回化驗室檢測。
[0051 ] (2)提取環(huán)境中細菌基因組RNA:利用TRI pure LS Reagent試劑盒提取樣品基因 組 RNA;
[0052] 3)按常規(guī)方法用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System將提取的樣品基 因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0053] 4)用上述熒光定量PCR MIX試劑進行Real-time PCR，儀器為LightCycler? 480Real-Time PCR System，反應(yīng)體系為：熒光定量PCR MIX試劑 10yL、Primer-l 0.5yL、 Primer-2 0.5yL、cDNA lyL、無菌水補至20yL，其中16sRNA通用引物、blaTEM引物的濃度均 為0·5ymol/L;
[0054] 反應(yīng)條件:PCR擴增時預(yù)孵育95°C，時間5min;變性溫度為95°C，反應(yīng)時間為10s;擴 增溫度72°C，時間30s;循環(huán)數(shù)為45。反應(yīng)結(jié)束后作熔解曲線分析。
[0055] 5)定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Real-time PCR專用儀為LightCyC丨e#48〇n上裝有 MghtCycler:|i軟件對結(jié)果進行分析。根據(jù)耐藥基因 blaTEM基因和16sRNA通用的Ct值，通過 相對Ct法即2_Λ ^法，來計算b laTEM基因 mRNA的相對表達量。
[0056] 6)實驗結(jié)果如表1和圖1所示。
[0057] 表1某養(yǎng)雞場地面樣品中blaTEM基因檢測情況
[0059] 如表1所示，對某養(yǎng)雞場空舍期和養(yǎng)殖期地面樣品檢測結(jié)果表明，養(yǎng)殖期blaTEM基 因的表達水平明顯上調(diào)，養(yǎng)殖期4為空舍期的6.9倍，與空舍期差異顯著，通過這一檢測數(shù) 據(jù)，可以輔助評價養(yǎng)禽場環(huán)境耐藥基因存在及消長情況。
[0060] 由圖1可知b laTEM基因引物熔解曲線顯示，引物特異性良好。
[0061 ] 實施例5
[0062]利用本發(fā)明的引物對不同菌株大腸桿菌blaTEM基因檢測，菌株具體為:blaTEM基 因陰性標準菌株、blaTEM基因陽性標準菌株和藥敏試驗結(jié)果陽性的分離菌株和藥敏試驗陰 性的分離菌株(其中1. blaTEM基因陰性標準菌株，2. blaTEM基因陽性標準菌株，3-7.藥敏試 驗陽性的分離菌株，8-10.藥敏試驗陰性的分離菌株)進行PCR擴增，具體結(jié)果見圖2。由圖2 可知耐藥基因 blaTEM基因陰性標準菌株和藥敏試驗結(jié)果陽性的分離菌株均出現(xiàn)特異性條 帶，而blaTEM基因陰性標準菌株和藥敏試驗陰性的分離菌株均未出現(xiàn)特異性條帶，
[0063]利用本發(fā)明的引物對不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結(jié)果，菌株具體為： b laTEM基因陰性標準菌株、b laTEM基因陽性標準菌株和藥敏試驗結(jié)果陽性的分離菌株和藥 敏試驗陰性的分離菌株(其中1. blaTEM基因陰性標準菌株，2. blaTEM基因陽性標準菌株，3- 7.藥敏試驗陽性的分離菌株，8-10.藥敏試驗陰性的分離菌株)進行PCR擴增，具體結(jié)果見圖 3。由圖3可知不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結(jié)果:10株大腸桿菌均檢出16s RNA基因。
[0064] 利用本發(fā)明的引物對腸道桿菌科不同細菌blaTEM基因檢測結(jié)果，7種細菌分別為： 1.大腸桿菌2.芽孢桿菌3.葡萄球菌4.克雷伯氏菌5.變形桿菌6.不動桿菌7.陰溝腸 桿菌，具體結(jié)果見圖4。由圖4可知大腸桿菌、變形桿菌、克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌檢測到 blaTEM基因，芽孢桿菌、葡萄球菌和不動桿菌未檢出該基因。由圖1-4可知，本發(fā)明的引物具 有良好的特異性。
[0065] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒，其特征在于，包括熒光定 量PCRMIX試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 blaTEM引物； 所述的16 sRNA通用引物包括 16sRNA通用引物1:5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'， 16sRNA通用引物2:5 '-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3 ' ； 所述的耐藥基因 b 1 aTEM引物包括 耐藥基因 b 1 aTEM 引物 1:5 ' -CGGTATTATCCCGTGTTG-3 ' ； 耐藥基因 blaTEM引物2:5 '-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒，其 特征在于:所述的16sRNA通用引物的濃度為0.1~0.5ymol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度 為0·1~0·5ymol/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒，其 特征在于:所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶； 濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。4. 一種權(quán)利要求1-3任一項所述的一種焚光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的 試劑盒的用途:其特征在于:用于對內(nèi)酰胺類藥物耐藥性進行定量檢測。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒的 用途，其特征在于:所述的β-內(nèi)酰胺類藥物為頭孢菌素。6. -種養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-3任一項所 述的試劑盒，包括以下步驟： (1) 采集環(huán)境細菌檢測樣品。 (2) 提取環(huán)境中細菌基因組RNA; (3) 將步驟(2)所得的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA; (4) 將步驟(3)得到的cDNA加入到熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測試劑盒，混 勻，進行PCR擴增； (5) PCR擴增結(jié)束后，根據(jù)熒光實時定量PCR儀對結(jié)果進行分析，根據(jù)耐藥基因 blaTEM和 16sRNA基因的Ct值，通過相對Ct法計算耐藥基因 mRNA的相對表達量，即為耐藥基因表達的 信息。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的檢測方法，其特征在于:所述 的PCR擴增的條件為PCR擴增時預(yù)孵育95°C，時間5min;變性溫度為95°C，反應(yīng)時間為10s;擴 增溫度72 °C，時間30s;循環(huán)數(shù)為45。
【文檔編號】C12Q1/02GK105936931SQ201610237208
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】沈美艷, 張廣斌, 孫秋艷, 李舫, 袁東芳, 于海
【申請人】山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院