檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水生動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著羅非魚的大量養(yǎng)殖，羅非魚鏈球菌病發(fā)病率越來越高，其發(fā)病面積之廣、危害程度之重已成為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要障礙，造成了養(yǎng)殖戶重大的經(jīng)濟(jì)損失。在農(nóng)業(yè)部2008年新修訂的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中，魚類鏈球菌病被列為三類動(dòng)物疫病，其主要的病原菌是無乳鏈球菌和海豚鏈球菌。目前，國(guó)內(nèi)還沒有研發(fā)出特效的藥物來防控羅非魚鏈球菌病。因此，建立一種羅非魚無乳鏈球菌快速檢測(cè)體系，對(duì)羅非魚養(yǎng)殖的快速發(fā)展能起到積極的作用。
[0003]無乳鏈球菌(51agaJaciiae)又稱為 B 群鏈球菌(group B Streptococcus, GBS)。無乳鏈球菌的血清學(xué)分類是依據(jù)其菌株的莢膜多糖的特異性而展開的。目前已經(jīng)鑒定出10 種不同的莢膜類型(Ia、Ib、I1、II1、IV、V、V1、VI1、VII 和 IX)，其中 Ia，Ib 和 III 型為目前已確定的水生動(dòng)物源血清型。另外，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)表面免疫相關(guān)蛋白基因(surface immunogenic protein, sip)存在于血清型 Ia、Ib、I1、II1、V 和 VI 中，表明si/謹(jǐn)因存在于水生動(dòng)物源的三種血清型中。因此，具有高度的序列保守性，可成為羅非魚無乳鏈球菌檢測(cè)的重要候選基因。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)具有特異性高，操作簡(jiǎn)單，肉眼可判斷結(jié)果的特點(diǎn)，適用于基層水產(chǎn)科研機(jī)構(gòu)及水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的使用，具有重要實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用于病原微生物及寄生蟲的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的引物。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)施的:
一種檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物，其由I對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，所述的外引物由引物和組成，所述的內(nèi)引物由引物Siz^FIP和sip-^,Ι?組成；
其中所述的外引物的序列如下: siir-V?,:5> - AGTTTCTGTTGCAGACC - 3’ siir-m:5> - CTGAAGTAATCGACTTCACAG - 3’；
其中所述的內(nèi)引物的序列如下: sip-FIP:
5’ - CGAAACAATCGTTGTTGCTGCTTAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGG - 3’sip-MP:5’ - GCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAGCTGGTGATACCTGTTCAT - 3’。
[0007]一種如上所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物的應(yīng)用:在制備羅非魚無乳鏈球菌快速診斷試劑中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明是根據(jù)無乳鏈球菌基因組中si/謹(jǐn)因序列特征，設(shè)計(jì)特異性的LAMP檢測(cè)引物，根據(jù)所設(shè)計(jì)的LAMP引物，建立了檢測(cè)無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。
[0009]本發(fā)明的有益效果在于:
O以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的LAMP引物建立的檢測(cè)無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，不與水生動(dòng)物常見的幾種病原菌及常見的鏈球菌屬的病原菌發(fā)生非特異性反應(yīng)，不需要昂貴儀器設(shè)備，時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益；
2)以本發(fā)明引物所建立的LAMP檢測(cè)方法能在60分鐘內(nèi)檢測(cè)出30個(gè)菌落數(shù)/mL的無乳鏈球菌；同時(shí)，在本發(fā)明的LAMP反應(yīng)體系中，加入了一種綠色熒光染料SYBP Green I，該染料在反應(yīng)液配置時(shí)加入，反應(yīng)結(jié)束后，無需開蓋，直接根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，能有效的降低污染的可能性。
[0010]具體實(shí)施方法
本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
[0011]實(shí)施例1
1、LAMP實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌si/T基因序列與本實(shí)驗(yàn)室從我省發(fā)病漁場(chǎng)中分離的無乳鏈球菌相比較，選擇基因前段保守序列，用Primer Explorer IV軟件分析設(shè)計(jì)引物，分別為Siz^FIP 和.52>ΒΙΡ，具體序列見 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ
ID N0.3、SEQ ID N0.4。
[0012]2.菌株
包括2株羅非魚無乳鏈球菌株(患病羅非魚分離菌)，8株其它鏈球菌屬菌株(海豚鏈球菌、停乳鏈球菌、2株II型豬鏈球菌、牛鏈球菌、馬腸鏈球菌、釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌等)及6株水體常見菌株(嗜水氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、2株豚鼠氣單胞菌、2株大腸桿菌)。
[0013]3.細(xì)菌DNA提取
無乳鏈球菌接種腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，28°C過夜培養(yǎng)，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(購(gòu)買于泰京生物技術(shù)公司)提取DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0014]4.LAMP反應(yīng)體系
LAMP 反應(yīng)體系為 25 yL。其中 F3 與 Β3(50 μπιοΙΓ1 )各 0.1 μ L、FIP 與 BIP (50 μ molL-1)各0.4 μ L、1.0 μ L Bst DNA 聚合酶(8 UL-1 )、2.5 μ L 1XBst buffer,3.0 μ L Mg2+(25μ molL:) >3.0 μ L dNTPs (10 μ molL 1 )、2.5 μ L甜菜喊(8 Μ)、10.0 μ L滅菌蒸飽水、I μ LSYBR Green I (稀釋100倍)、1.0 μ LDNA模板?；靹蚝髮⒎磻?yīng)液放入恒溫水浴鍋，61°C反應(yīng)60 min。觀察顏色變化。
[0015]5.LAMP特異性實(shí)驗(yàn)
提取8株鏈球菌屬和6株水體常見病原菌的DNA，反應(yīng)產(chǎn)物。
[0016]6.LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)
無乳鏈球菌接種腦心浸液固體培養(yǎng)基(BHI)純培養(yǎng)后，用滅菌的生理鹽水洗脫，洗脫液進(jìn)行10倍倍比稀釋，各取每個(gè)稀釋度的菌液I mL，用試劑盒提取DNA后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。
[0017]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.LAMP特異性實(shí)驗(yàn)
LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光顯色結(jié)果，2株無乳鏈球菌的反應(yīng)組顏色變?yōu)榫G色，其它14株非無乳鏈球菌保持橙色未變，證明本方法具有良好的特異性。
[0018]2.LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)
經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始無乳鏈球菌菌液濃度為3.0X 18 CFU.mL' 10倍倍比稀釋菌液并提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)菌液稀釋到3.0 X 10 CFU.mL—1時(shí)仍可見梯狀擴(kuò)增產(chǎn)物，LAMP法檢測(cè)靈敏度達(dá)30CFU.mL'
[0019]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物，其特征在于:由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，所述的外引物由引物和組成，所述的內(nèi)引物由引物^i/T-FIP 和 5.Υ/τ~ΒΙΡ 組成；siir-V?,:5’ - AGTTTCTGTTGCAGACC - 3’，siir-m:5’ - CTGAAGTAATCGACTTCACAG - 3’，sip-FIP:5’ -CGAAACAATCGTTGTTGCTGCTTAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGG - 3’，sip-MP:5’ - GCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAGCTGGTGATACCTGTTCAT - 3’。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引物的應(yīng)用，其特征在于:在制備羅非魚無乳鏈球菌快速診斷試劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，所述引物根據(jù)羅非魚無乳鏈球菌表面免疫相關(guān)基因的保守序列設(shè)計(jì)，其分別為<i>sip</i>-F3、<i>sip</i>-B3、<i>sip</i>-FIP和<i>sip</i>-BIP。具體序列見SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3、SEQ？ID？NO.4。根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物能建立一種檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。該方法不與水生動(dòng)物常見的幾種病原菌及常見的鏈球菌屬的病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)。本發(fā)明的檢測(cè)方法不需要昂貴儀器設(shè)備，時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。
【IPC分類】C12Q1-14, C12Q1-68, C12R1-46, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104561267
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410686448
【發(fā)明人】鄭磊, 樊海平, 吳斌, 曾占?jí)?
【申請(qǐng)人】福建省淡水水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日