等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑及等溫核酸擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種靈敏度高的可在等溫下 實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑和等溫核酸擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)自1983年由Mullis等發(fā)明W來(lái)，在生命科學(xué)研究等方 面得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中，在存在DNA模板、引物、四種dTTP、適當(dāng)?shù)木彌_液的反應(yīng) 混合物的條件下，通過DNA聚合酶催化從而對(duì)目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)一般包括變 性、退火和延伸Ξ個(gè)步驟，每個(gè)步驟重復(fù)30至40次，由此對(duì)少量目的DNA片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò) 增已達(dá)到可W檢測(cè)的水平。由于PCR技術(shù)可將少量核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增達(dá)到儀器可檢測(cè)的水 平，因此迅速應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，例如，疾病診斷、動(dòng)植物病理學(xué)研究、微生物檢測(cè)等等。
[0003] 基于PCR的強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，在實(shí)際應(yīng)用中，將PCR與其它分子生物學(xué)方法W及免 疫學(xué)方法等相結(jié)合發(fā)展得到了多種檢測(cè)技術(shù)，例如巧光定量PCR技術(shù)、多重PCR檢測(cè)技術(shù)等 已在疾病檢測(cè)方面得到廣泛使用。
[0004] 然而，出于熱循環(huán)過程中溫度變化和特定溫度條件要求，傳統(tǒng)PCR技術(shù)要求儀器必 須具備精細(xì)的溫度控制程序，能夠在預(yù)定時(shí)間準(zhǔn)確地升降溫度，從而實(shí)現(xiàn)溫度的循環(huán)變化， 運(yùn)大大增加了儀器研制成本，使儀器價(jià)格昂貴，并且由于溫度的變化和維持完全依賴于電 源，因此電力消耗非常大。目前已經(jīng)研發(fā)出多種等溫體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，如TMA技術(shù)(轉(zhuǎn)錄介 導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)）、SDA技術(shù)(鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)）、LAMP肺介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)）、HDA(解 旋酶依賴等溫核酸擴(kuò)增技術(shù))等等，運(yùn)些技術(shù)在恒定的溫度(60至65度)下就可W實(shí)現(xiàn)高效 的核酸擴(kuò)增，從而使無(wú)需使用對(duì)溫度進(jìn)行精準(zhǔn)控制的PCR儀。然而運(yùn)些技術(shù)需要的溫度仍然 較高，如果能實(shí)現(xiàn)在更低溫度下進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增，則將使核酸擴(kuò)增技術(shù)變得更加節(jié)能和 簡(jiǎn)單易行，并進(jìn)一步擴(kuò)大核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引針對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌recA蛋白 可在常溫條件下與單鏈DNA結(jié)合，在T4隧菌體DNA解旋酶gp41蛋白打開DNA雙鏈的前提下，將 結(jié)合的單鏈DNA與同源互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行置換作用，在單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶的存在下進(jìn)行 鏈的延伸反應(yīng)，從而在恒溫等溫條件下實(shí)現(xiàn)特定核酸序列的指數(shù)擴(kuò)增，該核酸擴(kuò)增過程可 降低對(duì)體外核酸擴(kuò)增儀器的要求，使得核酸擴(kuò)增過程在常溫等溫條件下即可實(shí)現(xiàn)，不需要 傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增的機(jī)械式升溫降溫過程。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種等溫核酸擴(kuò)增試劑，所述等溫核酸擴(kuò)增試劑包括： Tris-HCl緩沖液 100-800 mM 氯化?鋼 10-150 mM 氯化鐘 10-150 mM 氯化鎮(zhèn) 10-50 mM 二硫蘇糖醇 5-15 mM 聚乙嬌化咯燒醜 5-20% ATP 10-20 mM dNPTs 1-5 mM
[0007] 鱗酸蹄醇丙禍酸 10-50 mM 丙固同酸激酶 500-1500 ng/μL BSA 100-500 ng/μL 引物組 每種引物25-200 pmol T4途菌體DNA解旋酶gp41蛋白 50-200 ng/μL 天藍(lán)色鏈霉菌recA蛋白 100-500 ng/μL 單鏈結(jié)合蛋白 200-1000 ng/μL 大腸桿菌DNA聚合酶I 50-200 ng/yL
[0008] 本發(fā)明的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，是指在恒定的溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。優(yōu)選地，本發(fā)明 的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑的反應(yīng)溫度為20°C至42°C。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述試劑中的化is-HCl緩沖液的抑為8.0,聚乙締化 咯燒酬(PVP)的分子量為40000-1200000，優(yōu)選為360000。
[0010] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述引物組包括至少兩種引物。
[0011] 在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，所述反應(yīng)試劑還包括巧光染料。所述巧光染料為 SYBRGREEN USYT0-13或者SYT0-82。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供一種等溫核酸擴(kuò)增方法，所述方法包括W下步驟：（1)提供 DNA或cDNA模板；（2)加入本發(fā)明的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，在20°C至42°C下反應(yīng)15分鐘至 50分鐘，完成核酸擴(kuò)增。其中，所述等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑中的引物組根據(jù)步驟(1)中的DNA 或cDNA模板設(shè)計(jì)得到。
[0013] 本發(fā)明試劑中的引物，是指可用于特異性擴(kuò)增目標(biāo)核酸的寡核巧酸鏈，長(zhǎng)度為28- 36個(gè)堿基之間，引物序列不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)、回文序列W及連續(xù)的重復(fù)堿基序列；引物的化 值不作為設(shè)計(jì)主要素。
[0014] 本發(fā)明試劑中的四種酶蛋白：隧菌體DNA解旋酶即41蛋白、天藍(lán)色鏈霉菌recA蛋 白、單鏈結(jié)合蛋白和大腸桿菌DNA聚合酶I在擴(kuò)增反應(yīng)的過程中行使不同功能，缺一不可，通 過運(yùn)些酶蛋白的相互作用在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的快速體外擴(kuò)增。
[0015] 本發(fā)明提供的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑及等溫核酸擴(kuò)增方法可在20°C至42°C的較 低恒定溫度下對(duì)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增;通過設(shè)計(jì)多組引物，可同時(shí)進(jìn)行多重核酸擴(kuò)增;本發(fā)明 的鏈置換反應(yīng)系統(tǒng)還可W包含巧光染料，所述的巧光染料可W是SYBRGREEN USYT0-13或 者SYT0-82,可W根據(jù)巧光直接判讀擴(kuò)增結(jié)果，實(shí)現(xiàn)在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的核酸擴(kuò)增檢測(cè)及其 結(jié)果判讀。由此可見，通過本發(fā)明提供的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑和等溫核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行 核酸擴(kuò)增在很大程度上降低了對(duì)儀器W及技術(shù)的要求，大大簡(jiǎn)化了核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程。
【附圖說明】
[0016] 圖1為實(shí)施例1中等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，泳道1顯示W(wǎng)樣本1為模板的核酸 擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2顯示W(wǎng)樣本2為模板的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 圖2為實(shí)施例2中等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，泳道1顯示W(wǎng)樣本3為模板的核酸 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018] 圖3為實(shí)施例3中等溫核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，泳道1顯示W(wǎng)樣本4為模板的核酸 擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2顯示W(wǎng)樣本5為模板的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3顯示W(wǎng)樣本6為模板的核酸擴(kuò) 增產(chǎn)物，泳道4和5分別顯示W(wǎng)樣本4和樣本6為模板的二重核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6和7分別顯 示W(wǎng)樣本4、樣本5和樣本6為模板的Ξ重核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，W下實(shí)施例僅僅是為了舉 例說明，對(duì)發(fā)明不構(gòu)成任何限定。
[0020] 除非另有說明，本發(fā)明采用的分子生物學(xué)、基因工程等生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，運(yùn) 些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的范圍之內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因玉米N0S終止子的基因擴(kuò)增
[0022] 轉(zhuǎn)基因玉米含有N0S終止子，而野生型玉米則沒有該基因序列，因此，可W通過對(duì) 該序列進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)鑒別轉(zhuǎn)基因玉米。在本實(shí)施例中，通過采用本發(fā)明提供的等溫?cái)U(kuò)增試劑 和方法來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的N0S終止子進(jìn)行檢測(cè)。
[0023] (1)引物設(shè)計(jì)
[0024] 選擇玉米N0S終止子的全序列提交至美國(guó)國(guó)家生物中屯、網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp://WWW.ncbi .nlm.n:ih. gov/)進(jìn)行Blast檢索，通過網(wǎng)站Blast程序分析尋找NOS終止子和玉米 的基因組序列沒有高同源性的DNA片段。根據(jù)Blast結(jié)果在N0S終止子中選取了一段253bp的 序列（SEQ ID No. 1)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[002引 模板序列（SEQ ID No.l):
[0026] cgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttct gttg曰曰tt曰cgtt曰曰gc曰tgt曰曰t曰曰tt曰曰c曰tgt曰曰tgc曰tg曰cgtt曰ttt曰tg曰g曰tgggttttt曰tg曰tt曰g曰g tcccgc曰曰tt曰t曰c曰ttt曰曰t曰cgcg曰t曰g曰曰曰曰c曰曰曰曰t曰t曰gcgcgc曰曰曰ct曰gg曰t曰曰曰tt曰tcgcgcgcggtg tcatctatgttactagatcggg [0027]引物；
[0028] 正向引物5'gattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc 3'沈Q ID N0:2
[0029] 反向引物5'gtttgcgcgctatattttgttttctatcgcgta 3'沈Q ID N0:3
[0030] (2)玉米基因組DM的提取
[0031] 在通風(fēng)楓中，使用植物基因組DM提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司，步驟 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米樣本提取高純度DNA，得到DNA樣本50μ1，標(biāo)記為 樣本1;及非轉(zhuǎn)基因玉米樣本提取的DNA樣本50μ1標(biāo)記為樣本2。
[0032] (3)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)
[0033] 從樣本1和樣本2中各取出化1到一個(gè)新的20化1的PCR管中，再加入49μ1等溫核酸 擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑(保存于-20°C冰箱），其成分如下： Tris-HCl緩沖液（p'H 8.0) 200 mM 氯化銅 80 mM 氯化鐘 70 mM 氯化緩 20 mM 二瑞蘇糖醇 8 mM 聚乙締化咯燒綱40000 10% ATP 12 mM dNPTs 4 mM
[0034] 礎(chǔ)酸蛛醇丙禍酸 20 mM 巧固同酸激晦 800ng/Ml 引物A ( SEQ ID NO:5 ) 25 pmol 引物B ( SEQ ID NO:6 ) 25 pmol T4唾菌體DNA解旋酶gp41蛋白 80 ng/μL 天藍(lán)色鏈霉菌recA蛋白 200η§/μ1 單鏈結(jié)合蛋白 SOOng/ul 大腸桿菌DNA聚合酶I 120 ng/ μ 1
[003引將PCR管放入37°C等溫金屬浴解育30min。隨后將PCR管取出，向PCR管中加入50μ1 酪/氯仿（酪：氯仿：異戊醇=25 :24:1，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司），縱滿震蕩30s， 1200化pm離屯、5min，取祉1上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如附圖1所示，可W看到對(duì)樣本 1進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)到176bp的目的條帶，而對(duì)樣本2則沒有檢測(cè)到目的條帶。由此可見，使用本 發(fā)明提供的等溫?cái)U(kuò)增試劑和方法，可W對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米N0S終止子的特定位置進(jìn)行有效鏈替 換擴(kuò)增，用于檢測(cè)含有N0S終止子的轉(zhuǎn)基因玉米。
[0036] 實(shí)施例2對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群的檢測(cè)
[0037] 在本實(shí)施例中，通過本發(fā)明提供的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群 (MTBC)的插入序列IS6110基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，W實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌