B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(loop-mediated isothermalamplificat1n of DNA,LAMP)技術(shù)進行菌樣快速檢測的生物檢測試劑,具體涉及一種B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)又稱為肉毒桿菌或肉毒梭菌，是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，有鞭毛、無莢膜、產(chǎn)芽孢，由于芽孢比營養(yǎng)體寬，故呈梭狀。肉毒梭狀芽胞桿菌在自然環(huán)境中廣泛存在，其芽孢熱抵抗力較強，是引起食物中毒病原菌中熱抵抗力最強的菌種之一。在厭氧條件下，該菌會產(chǎn)生強烈的細(xì)菌外毒素-肉毒毒素(Botulinum neurotoxin, BoNTs),肉毒毒素與神經(jīng)元突觸前膜受體結(jié)合,通過與神經(jīng)細(xì)胞中的特異性底物蛋白相作用，阻止神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿的釋放，造成全身肌肉包括呼吸肌的松弛性麻痹，最終導(dǎo)致患者死亡。肉毒毒素是目前已知的毒性最強烈的生物毒素之一，其成人致死量僅為0.1-1.0μ g，可用來制造生化武器。根據(jù)肉毒毒素的抗原性差異，可將肉毒桿菌分為A、B、C、D、E、F、G七種血清型，其中A、B、E、F型能夠引起人類中毒，而在我國以B型肉毒毒素中毒最為常見，A型和E型次之。
[0003]肉毒毒素的傳播主要有三種類型，分別為食源性肉毒毒素中毒、創(chuàng)傷性肉毒毒素中毒和嬰兒肉毒毒素中毒。根據(jù)國內(nèi)外已有報道，在人類肉毒毒素中毒案例中，由于進食了含有肉毒毒素食品所引起的食源性肉毒毒素中毒最為常見。其原因主要是由于食品在制作過程中被肉毒桿菌芽孢污染，其后未進行滅菌或滅菌不徹底，芽孢在厭氧環(huán)境中發(fā)芽繁殖，并產(chǎn)生肉毒毒素，如果含有毒素的食品在食用前又未經(jīng)過充分加熱，就可能會造成食源性的肉毒毒素中毒。在歐美國家，引起肉毒中毒的食品主要包括罐頭、乳制品、真空包裝食品和冷凍食品等；而在我國，則以面制品和發(fā)酵豆制品居多。
[0004]目前針對肉毒梭狀芽孢桿菌有多種檢測方法。傳統(tǒng)的增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)方法(國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.12-2003) 一般需要10天以上，周期較長，且需要使用實驗動物，成本較高；免疫學(xué)檢測(Immunoassay, IA)是一種根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理,利用已知的抗原檢測未知抗體或利用已知的抗體檢測未知抗原的技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、放射免疫(RIA)、反向間接血凝法(RPHA)和反向乳膠凝集實驗(RPLA)等，此類方法周期短，一次可檢測大量樣本，且不需實驗動物，但其缺點是必須有高親和性的抗體；實時熒光定量PCR方法能夠用于病原菌的檢測，但對儀器設(shè)備和人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，且操作復(fù)雜，耗時較長，限制了該技術(shù)的推廣。
[0005]DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)是一種新型的恒溫核酸擴增方法，此技術(shù)克服了以往基因擴增方法的不足，能夠在恒溫條件下進行核酸的擴增，具有簡單、快速、成本低、特異性強等優(yōu)點，適于現(xiàn)場檢測，有較好的應(yīng)用性。目前，還沒有專門針對B型肉毒梭狀芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種快速靈敏準(zhǔn)確的B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下試劑:
(1)反應(yīng)液1:10mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10XThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂(MgS04)、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水(ddH20)；
(2)反應(yīng)液2:10ymol/L 外引物 I (F3)、10 ymol/L 外引物 2 (B3)、40 ymol/L 內(nèi)引物I (FIP)和40 ymol/L內(nèi)引物2 (BIP)，引物序列如下:
外引物 1:GTGTTCCACTCGAAGAGTT 外引物 2:CATATTCTGGGCAAAACTTCA
內(nèi)引物 1:TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT內(nèi)引物 2:ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTC ；
(3)8U/y L Bst DNA 聚合酶；
(4)顯色劑:質(zhì)量濃度為10%的SYBRGreen I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液I折合每樣品19yL，其組成為:10mmol/L 脫氧核苷三磷酸(dNTP) 4 μ L、10X ThermoPol Buffer 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L、150mmol/L硫酸鎂(MgSO4) I μ L、5mol/L甜菜堿5 μ L和滅菌雙蒸水(ddH20)6.5 μ L ;反應(yīng)液2折合每樣品3 μ L，其組成為:10ymol/L外引物I (F3)0.5 μ L、10 μ mol/L外引物2 (B3)0.5μ L、40ymol/L 內(nèi)弓丨物 I (FIP) I μ L 和 40 μ mol/L 內(nèi)弓丨物 2 (BIP)IyL0
[0008]本發(fā)明還提供了一種B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測方法，其特征在于包括如下步驟:
步驟一，提取待檢樣品的基因組DNA ；
步驟二，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)，取2 μ L待檢樣品DNA溶液，加入19 μ L反應(yīng)液1、3 μ L反應(yīng)液2和I μ L 8U/ μ L Bst DNA聚合酶，反應(yīng)體系總體積25 μ L，將配置好的反應(yīng)體系在65 °C下擴增反應(yīng)50-70 min后取出待檢；
步驟三，分析判斷反應(yīng)結(jié)果，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入I μ L顯色劑，混勻，靜置2min，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。
[0009]本發(fā)明根據(jù)B型肉毒梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)毒素基因如/7?/Β設(shè)計了四條特異性引物，該基因序列為B型肉毒梭狀芽孢桿菌所共有，以保證檢測不同來源的B型肉毒梭狀芽孢桿菌的可靠性。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，針對B型肉毒梭狀芽孢桿菌建立了快速靈敏準(zhǔn)確的檢測方法，并構(gòu)建用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發(fā)明的快速檢測試劑盒和檢測方法，在反應(yīng)后可通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟，具有檢測時間短、特異性強、儀器設(shè)備要求低、操作簡便等優(yōu)點，可用于食品、臨床及環(huán)境等樣品的安全快速檢測。
【附圖說明】
[0010]圖1是不同菌株的陽性擴增結(jié)果對比圖，其中2號反應(yīng)瓶內(nèi)樣品為綠色，I和3-8號反應(yīng)瓶內(nèi)樣品為橙色。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明中試劑盒及檢測方法的建立和應(yīng)用作進一步說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0012]實施例1
B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其檢測方法的建立步驟一，引物的設(shè)計、合成試劑盒的組裝本實施例確定用于檢測的引物序列如下:
外引物 1:GTGTTCCACTCGAAGAGTT 外引物 2:CATATTCTGGGCAAAACTTCA
內(nèi)引物 1:TTCGCTCCACTTCTCCTGGACAAACATTGCTAGTGTAACTGTT內(nèi)引物 2:ACCTGGGCCAGTTTTAAATGAAAATTATACCCCCGAAGCCTTCo
[0013]在此基礎(chǔ)上設(shè)計用于B型肉毒梭狀芽孢桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑:
(1)反應(yīng)液1:10mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10XThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂(MgS04)、5 mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水(ddH20)；
(2)反應(yīng)液2:10 μ mol/L 外引物 I (F3)、10 μ mol/L 外引物 2 (Β3)、40 μ mol/L 內(nèi)引物I (FIP)和 40 μ mol/L 內(nèi)引物 2 (BIP)；
(3)8U/y L Bst DNA 聚合酶；
(4)顯色劑:質(zhì)量濃度為10%的SYBRGreen I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液I折合每樣品19yL，其組成為:10mmol/L 脫氧核苷三磷酸(dNTP) 4 μ L、10X ThermoPol Buffer 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L、150mmol/L硫酸鎂(MgSO4) I μ L、5mol/L甜菜堿5 μ L和滅菌雙蒸水(ddH20)6.5 μ L ;反應(yīng)液2折合每樣品3 μ L，其組成為:10 μ mol/L外引物I (F3)0.5 μ L、10 μ mol/L外引物2 (B3)
0.5 μ L、40 μ mol/L 內(nèi)弓丨物 I (FIP) I μ L 和 40 μ mol/L 內(nèi)弓丨物 2 (BIP)IyL0
[0014]步驟二，待