專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的h5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。 疼豕伎不
目前對(duì)H5禽流感病毒有多種檢測(cè)方法，從以病原微生物分離鑒 定、形態(tài)學(xué)鑒定和血清學(xué)鑒定為主的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18936—2003)， 到特異蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技 術(shù)等分子生物學(xué)檢測(cè)方、法(GB 19438.1-2004、 GB/T 19439-2004)。 其中病原核酸檢測(cè)在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很 大的提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等微生物學(xué) 檢測(cè)舊模式，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離提純，而直接用樣品或樣品的 增菌液對(duì)其基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及 生物信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動(dòng)化的方向發(fā)展。
以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)在實(shí) 際應(yīng)用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要 專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交 叉污染的問題，并簡(jiǎn)化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù) 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快 速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確 性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最 新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。其中等 溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè) 技術(shù)上的長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 具有很多的優(yōu)越性，且目前也未見有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核 分歧桿菌的基因快速診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)成本低、 使用方便、檢測(cè)快速高效、靈敏度高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的 H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增技術(shù)來檢測(cè)H5禽流感病毒的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述H5禽流感病毒基因快速診斷 試劑盒的檢測(cè)方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的
一、本發(fā)明的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，是由兩對(duì)引 物、B"DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、 顯色液和陽性對(duì)照液組成，以上八種液體分別置于容器中，其中 所述兩對(duì)引物為
外引物F3: GAC AGAGC AGGTTGAC AC;夕卜弓I物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC;
內(nèi)引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
內(nèi)引物BIP: GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGG CACATTGATGA;
上述反應(yīng)液含有1.6 2mmol/L dNTP、 20 25mmol/L Tris-HCl、 10 12.5mmol/L氯化鉀、10 12.5mmol/L硫酸銨、8 10mmol/L硫酸 鎂、0.1 0.125%TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP 各1.6 2mol/L和外引物F3/B3各0.2 0.25mol/L。優(yōu)選的比例是反 應(yīng)液含有2mmol/L dNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、 12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125 %TritonX-100、 lmol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。 (0.1 0.125XTritonX-100是Triton X-100占反應(yīng)液的體積百分比為0.1 0.125%)
上述逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
上述陽性對(duì)照為攜帶H5禽流感病毒基因的質(zhì)粒DNA。
上述顯色液優(yōu)選為SYBR Green I或EvaGreen。
上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。
二、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝
1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì)檢；
2、 將反應(yīng)液無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；3、 將穩(wěn)定液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、 將逆轉(zhuǎn)錄酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、 將RNA酶抑制劑無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；
6、 將陽性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
7、 組裝試劑盒。
三、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法
1、 樣品處理
樣品的采集、保存和處理，可采用GB/T 18936—2003中2.1款 進(jìn)行；
提取樣品核酸，可采用GB/T 19439-2004進(jìn)行樣品核酸提取獲 得樣品模板或使用等同的商品化核酸提取試劑盒按說明書操作提取 RNA模板。
2、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程
在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％、 Bst DNA聚合酶0.9 1.8體積％、逆轉(zhuǎn)錄酶0.9 L8體積％、 RNA酶抑制劑0.9 1.8體 積％、穩(wěn)定液52 54.5體積X、樣品模板RNA4.5 7.3體積％，63 65"C恒溫反應(yīng)45 90min。所述體積百分比是指占六個(gè)組分總體積 的體積百分比。
3、 反應(yīng)后處理
在上述反應(yīng)管和陽性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組 顯色與對(duì)照組相同則為陽性，否則為陰性。
本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isotherm
al amplication of DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)快速檢測(cè)H5禽流感病毒的方 法，是利用DNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、 外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識(shí)別靶序列上 的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈 合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié) 構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷 酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白 色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 6 5°C)條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒 有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、 容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員的 技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)便，不需要特殊的試劑和儀器 設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡(jiǎn)便、 快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù) (包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏 度、特異性和檢測(cè)范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且 不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，而且檢 測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國(guó)內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒 出售。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合 生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2 3天，完成 鑒定報(bào)告需10 15天；采用本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒僅需2 小時(shí)。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀 清晰。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的基因快 速診斷試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與 設(shè)備，檢測(cè)成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段， 四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷耙標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有 高特異性；3.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到 l小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒靈 敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試 劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2 +結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加 入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l試劑盒的制備
(1) 按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 夕卜弓I物F3: GACAGAGCAGGTTGACAC;
外引物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC; 內(nèi)引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
內(nèi)引物BIP:
GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA;
(2) 購(gòu)置DNA聚合酶fofDNA聚合酶置于容器。
(3) 配制反應(yīng)液反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol7L硫酸鎂、0. 125體積XTritonX-100、 lmol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L 和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。
(4)購(gòu)置逆轉(zhuǎn)錄酶AMV逆轉(zhuǎn)錄酶置于容器。
(5) 購(gòu)置RNA酶抑制劑RNA酶抑制劑置于容器。
(6) 購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器。
(7) 購(gòu)置顯色液SYBRGreenI，置于容器。
(8) 提取陽性對(duì)照提取含H5禽流感病毒基因的質(zhì)粒DNA，置 于容器。
(9) 將上述8個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。 制備工藝簡(jiǎn)述如下
1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì)檢；
2、 將反應(yīng)液無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；
3、 將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、 將BW酶分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、 將逆轉(zhuǎn)錄酶分裝，抽樣質(zhì)檢；
6、 將RNA酶抑制劑分裝，抽樣質(zhì)檢；
7、 將陽性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢； .8、將顯色液分裝，抽樣質(zhì)檢；
9、組裝試劑盒。
實(shí)施例2試劑盒的制備
反應(yīng)液的配方為反應(yīng)液含有1.6mmol/LdNTP、 20mmol/L Tris-Cl、 10mmol/L氯化鉀、10mmol7L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、 0.1體積XTritonX-100、0.8mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6mol/L 和外引物F3/B3各0.2mol/L。
顯色液為EvaGreen。
其他同實(shí)施例1。
實(shí)施例3 H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒的應(yīng)用
1、 樣品處理(模板RNA提取)
按照GB/T 18936—2003中2.1款的方法采集樣品，
按照GB/T 19439-2004的方法進(jìn)行樣品核酸提取獲得樣品模板。
2、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過程
(1)在200^1反應(yīng)管配制反應(yīng)體系反應(yīng)液22^1， fi^DNA聚合 酶0.5[il (4U)， AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5jJ、 RNA酶抑制劑0.5^1、穩(wěn)定液 30|il，模板RNA2.5ji1。
(2)將配制好的反應(yīng)管于63'C恒溫反應(yīng)lh。
3、 反應(yīng)后處理
向上述反應(yīng)管中加入2^1 SYBR Green I，混勻，同時(shí)也向陽性對(duì) 照管(提取含H5禽流感病毒基因的質(zhì)粒DNA)中加入SYBR Green I混勻，若反應(yīng)管與對(duì)照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽性，若反應(yīng)管顯現(xiàn)橙 色則為陰性。
權(quán)利要求
1、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對(duì)引物、Bst DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、顯色液和陽性對(duì)照液組成，以上八種液體分別置于容器中，上述兩對(duì)引物為外引物F3GACAGAGCAGGTTGACAC；外引物B3CCTTCTCCACTATGTAAGACC；內(nèi)引物FIPTAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACACATGCCCAAG；內(nèi)引物BIPGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA；上述反應(yīng)液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-Cl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；上述陽性對(duì)照為攜帶H5禽流感病毒基因的質(zhì)粒DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述顯色液為SYBR Green I或EvaGreen。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液含有 2mmol/L dNTP、 25mmol/LTris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L 硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、 lmol/L甜菜堿、內(nèi) 引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。
4、 利用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測(cè)H5禽流感病毒的方法，其 特征在于該方法包括如下步驟(1) 采集樣品；(2) 提取樣品核酸；(3) 在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％、 Bst DNA聚合酶0. 9 1.8體積％、逆轉(zhuǎn)錄酶0.9 1.8體積％、 RNA酶抑制劑0.9 1.8 體積％、穩(wěn)定液52 54.5體積％、樣品模板DNA 4.5 7.3體積％，恒溫反應(yīng)；(4) 在上述反應(yīng)管和陽性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣 品組顯色與對(duì)照組相同則為陽性，否則為陰性。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中，恒 溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65"C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法，其特征在于所述穩(wěn)定液為石 蠟油。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄酶為 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法，其特征在于所述顯色液為S YBR Green I或EvaGreen。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒由兩對(duì)引物、DNA聚合酶、反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對(duì)照液組成，以上八種液體分別置于容器中。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，更加明顯可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101338345SQ200810030108
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日
發(fā)明者曹以誠(chéng), 暉 李, 李志勇, 杜正平, 柯昌文, 王志強(qiáng), 譚惠媚, 洵 陳 申請(qǐng)人:廣州華峰生物科技有限公司