包衣菌體在有機(jī)介質(zhì)中生物合成共軛α-亞麻酸異構(gòu)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]共軛α -亞麻酸是α -亞麻酸的共軛異構(gòu)體，是一組十八碳共軛三烯酸的統(tǒng)稱，有多種位置異構(gòu)和幾何異構(gòu)體，如:c9，ill，cl5_共軛α-亞麻酸和ilO, cl2, cl5_共軛α -亞麻酸異構(gòu)體等。研究表明共軛α -亞麻酸具有抗癌、預(yù)防動脈粥樣硬化、減肥等生理功能，且其生理活性具有異構(gòu)體特異性，如:c9，til, cl5_共軛α-亞麻酸異構(gòu)體具有抗癌的作用。在自然界中，共軛α-亞麻酸主要存在于反芻動物的奶和肉的脂肪中，主要由d，ill，cl5_共軛α-亞麻酸等異構(gòu)體構(gòu)成，但其含量通常十分低，無法滿足以保健和醫(yī)療為目的的開發(fā)應(yīng)用。
[0003]為實(shí)現(xiàn)共軛α -亞麻酸的大量制備，人們已對微生物發(fā)酵合成共軛α -亞麻酸進(jìn)行了一些研究。目前，微生物發(fā)酵均在水溶液中進(jìn)行，由于所加的發(fā)酵底物一 α -亞麻酸是脂溶性物質(zhì)，因此α -亞麻酸加入發(fā)酵液前需經(jīng)乳化處理，且添加量受到限制，從發(fā)酵液中獲得共軛α -亞麻酸產(chǎn)物需經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，整個生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵周期長、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)。發(fā)明專利CN200410060670.9報道了通過干酪乳桿菌CGMCC 1.574來特異性生物合成c9，til, cl5-共軛α -亞麻酸異構(gòu)體的方法，底物添加量為lmg/mL，發(fā)酵時間長達(dá)42h，底物的轉(zhuǎn)化率小于50%，且菌體不能重復(fù)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種包衣菌體在有機(jī)介質(zhì)中生物合成共軛α -亞麻酸異構(gòu)體的方法，顯著縮短合成時間、提高產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率、降低生產(chǎn)成本。
[0005]本發(fā)明包括以下步驟。
[0006](I)菌體的透性化處理:收集處于對數(shù)生長期的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei ) CGMCC 1.574菌體，按每克濕菌體重懸于5mL透性化處理液中計，將濕菌體重懸于透性化處理液中(所述透性化處理液為體積百分比0.5-3.0%的曲拉通Χ-100，5-50 μΜ的α -亞麻酸，20-200mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液)，重懸菌體經(jīng)37°C處理20min，離心收集透性化菌體。
[0007](2)菌體包衣處理:透性化菌體用50mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液洗滌后，離心收集菌體，按每克透性化濕菌體重懸于20mL50mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液中計，將透性化濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，加入菌懸液體積百分比0.5-2.0%的吐溫-20混合均勻，于4-40°C處理2-6h，離心收集菌體，將菌體冷凍干燥后得到包衣菌體。
[0008](3)有機(jī)介質(zhì)中生物合成:按每克包衣菌體加入到600mL正己烷中計，將包衣菌體加入到正己烷中，攪拌均勻，加入正己烷體積百分比0.1-0.3%的α -亞麻酸，在4-40°C下反應(yīng) l-12h0
[0009](4)產(chǎn)物收集:離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進(jìn)行減壓蒸餾，回收正己烷，產(chǎn)物為c9, til, cl5-共軛α -亞麻酸異構(gòu)體。
[0010]本發(fā)明所述的步驟(I)中透性化處理液優(yōu)選為體積百分比1.0-2.0%的曲拉通Χ-100，15-35 μ M的α -亞麻酸，30_100mM、ρΗ5.8的磷酸鹽緩沖液。
[0011]本發(fā)明所述的步驟(2)中吐溫-20的加入量優(yōu)選為菌懸液體積百分比的0.75-1.5%。
[0012]本發(fā)明所述的步驟(2)中處理溫度優(yōu)選為4_25°C。
[0013]本發(fā)明所述的步驟(2)中處理時間優(yōu)選為3_5h。
[0014]本發(fā)明所述的步驟(3)中優(yōu)選加入正己烷體積百分比0.125-0.25%的α -亞麻酸，在15-30 °C下反應(yīng)2-6h。
[0015]本發(fā)明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復(fù)用于有機(jī)介質(zhì)中生物合成c9, til, cl5_共軛α -亞麻酸異構(gòu)體。
[0016]本發(fā)明所用的干酪乳桿菌(Zac1AaciWiAs casei) CGMCC 1.574，系中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏菌株，編號為1.574，該菌株能產(chǎn)生特異性的亞油酸異構(gòu)酶，能將多不飽和脂肪酸中的c9，cl2雙鍵異構(gòu)成c9，til共軛雙鍵，通過生物異構(gòu)化可將α -亞麻酸轉(zhuǎn)化成c9, til, cl5_共軛α -亞麻酸異構(gòu)體。目前，還沒有從該菌中分離到有確切催化活性的異構(gòu)酶純品。因此，該異構(gòu)化反應(yīng)可能是由多酶體系共同催化完成。
[0017]通過該包衣菌體在有機(jī)介質(zhì)中生物合成方法，在優(yōu)化條件下，含體積百分比0.15%α -亞麻酸的正己烷溶液反應(yīng)后所合成d，ill, cl5-共軛α -亞麻酸異構(gòu)體的含量為體積百分比0.138%，α -亞麻酸的轉(zhuǎn)化率為92.0%。本發(fā)明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復(fù)用于步驟(3)的有機(jī)介質(zhì)中生物合成c9，til, cl5_共軛α -亞麻酸異構(gòu)體，包衣菌體重復(fù)使用五次后，其催化活性仍大于90%。
[0018]針對現(xiàn)有微生物發(fā)酵合成共軛α -亞麻酸均在水溶液中進(jìn)行，整個生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵周期長，從發(fā)酵液中提取共軛α -亞麻酸產(chǎn)物困難，菌體不能重復(fù)使用，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低等諸多缺點(diǎn)。本發(fā)明提出了通過微生物菌體在有機(jī)介質(zhì)中將α-亞麻酸催化合成共軛α-亞麻酸的新方法。該方法首先通過曲拉通Χ-100處理干酪乳桿菌CGMCC 1.574，在保持菌體完整性的同時，提高菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，一方面可以確保在后續(xù)包衣處理時細(xì)胞內(nèi)的異構(gòu)酶表面能形成完整包衣層，另一方面可以提高反應(yīng)底物α -亞麻酸和產(chǎn)物共軛α -亞麻酸進(jìn)出菌體的速率，減少高濃度底物和產(chǎn)物對催化反應(yīng)的抑制作用，大大縮短反應(yīng)時間。
[0019]本發(fā)明在透性化處理菌體時，加入5-50 μΜ的α -亞麻酸，α -亞麻酸可以和菌體中亞油酸異構(gòu)酶催化活性中心結(jié)合，在菌體包衣處理時，能在酶的催化活性中心形成分子印跡，使菌體在冷凍干燥后酶的催化活性中心構(gòu)象不變，能在有機(jī)介質(zhì)中保持較高的催化活性。同時，本發(fā)明結(jié)合在菌體包衣處理過程中選用合適的磷酸鹽緩沖液、吐溫-20濃度和包衣溫度、時間，使所得包衣菌體在有機(jī)介質(zhì)中仍具有較高的催化能力。包衣后菌體中酶的熱穩(wěn)定性提高，每批次反應(yīng)時間僅需4h，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)水溶液中批次發(fā)酵所需的數(shù)天時間。
[0020]本發(fā)明所得包衣菌體在正己烷中有較高催化活性，只需離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進(jìn)行減壓蒸餾，回收正己烷，即可得到產(chǎn)物d，ill，cl5_共軛α-亞麻酸。離心所得包衣菌體可多次重復(fù)用于有機(jī)介質(zhì)中生物合成c9，til, cl5_共軛α -亞麻酸異構(gòu)體，顯著縮短了生產(chǎn)時間，提高了產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。此外，正己烷是食用油脂工業(yè)常用的有機(jī)溶劑，這也保證了本發(fā)明所得d，ill, Cl5-共軛α -亞麻酸的使用安全性。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)。
[0022]本發(fā)明直接對菌體進(jìn)行包衣處理，作為固定化酶用于催化反應(yīng)，一方面減少了酶分離純化的成本，避免了酶在提取時活性的損失；另一方面可以將多酶體系包在一起，使整個反應(yīng)過程得以順利進(jìn)行；再者包衣菌體顆粒大于包衣酶，易于從反應(yīng)溶液中分離出來，且過濾阻力較小，因此，包衣菌體更加適合用于連續(xù)反應(yīng)的柱式反應(yīng)器。
[0023]本發(fā)明通過包衣菌體在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)，避免了在傳統(tǒng)水溶液反應(yīng)體系中底物α-亞麻酸溶解度低和產(chǎn)物共軛α-亞麻酸提取困難的問題。包衣菌體中酶的熱穩(wěn)定性提高，每批次反應(yīng)時間僅需4h，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)水溶液中發(fā)酵所需的數(shù)天時間。包衣菌體可重復(fù)使用多次，顯著提高產(chǎn)品產(chǎn)量，且無環(huán)境污染，可顯著降低生產(chǎn)成本；而傳統(tǒng)水溶液體系發(fā)酵液中的菌體只能使用一次，生產(chǎn)成本高，且發(fā)酵廢液處理費(fèi)用高，易污染環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步地說明。
[0025]實(shí)施例1。
[0026]將活化的干酪乳桿菌QLactobacillus casei) CGMCC 1.574菌種接種到MRS培養(yǎng)基中，于30°C下培養(yǎng)20h，5000g離心1min收集菌體，將10克濕菌體重懸于50mL含體積百分比1.5%的曲拉通Χ-100、25 μΜ的α -亞麻酸和50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)的透性化處理液中，37°C水浴處理20min，5000g離心1min得到透性化菌體。
[0027]透性化菌體用50mL50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)洗滌后，6000g離心1min收