用于檢測IFITM3-rs12252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR引物和探針的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]流感（Influenza)因其傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，易引起暴發(fā)流行，嚴(yán)重威脅著人類的健康。雖然流感疫苗可以有效的預(yù)防流感的發(fā)生，但是流感病毒變異后可以削弱流感疫苗的效應(yīng)。如2009年爆發(fā)的甲型HlNl流感，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國確診的12.7萬例患者中，有8320例為重癥及危重病例，死亡196例。由此可見，流感，尤其是重癥流感已成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。[0003]干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(IFITM3)位于人類第11號染色體上，是近期發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抗囊膜病毒活性的蛋白，是由I型或II型干擾素（IFN)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，它可以通過抑制流感病毒和其他包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞而限制病毒復(fù)制，缺失IFITM3基因后，IFN的抗病毒作用會明顯變?nèi)?，由此，IFITM3是人體抗病毒免疫所必需的。[0004]最新研究發(fā)現(xiàn)，IF頂T3的基因多態(tài)性與流感重癥有關(guān)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有通過檢測單個堿基突變來預(yù)測流感重癥的相關(guān)報(bào)道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針。[0006]本發(fā)明的另一目的是提供含有所述特異性引物和探針的用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的試劑盒。[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，包括：[0008]正向引物F:5'-CTGTTGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；[0009]反向引物R:5，-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3，；[0010]PROB-T:5,-Fl-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-Q-3，；[0011]PROB-C:5，-F2-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-Q-3，。[0012]其中，F(xiàn)l和F2為不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，Q為熒光淬滅基團(tuán)。[0013]優(yōu)選地，F(xiàn)l為FAM，F(xiàn)2為HEX，Q為TAMRA。[0014]本發(fā)明還提供含有所述特異性引物和探針的用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的試劑盒。[0015]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。[0016]更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。[0017]本發(fā)明還提供所述特異性引物對及探針在檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性中的應(yīng)用。由于IFITM3的基因多態(tài)性（rsl2252-C基因型）與流感重癥有關(guān)，所述特異性引物對能夠有效地鑒定出IFITM3-rsl2252的不同基因型，IFITM3-rsl2252-C基因型因改變了IFITM3蛋白的N末端蛋白結(jié)構(gòu)而降低其限制病毒復(fù)制的能力。根據(jù)全球千人基因組數(shù)據(jù)顯示，IFITM3-rsl2252-C基因型在歐洲白種人中很罕見，而在亞洲人群中更為常見。更重要地，結(jié)合rsl2252-CC基因型易于發(fā)生流感重癥的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果表明中國人群中發(fā)生嚴(yán)重感染的群體歸因風(fēng)險(xiǎn)度高達(dá)54.3%。有臨床研究發(fā)現(xiàn)2009年的HlNl流感大流行時(shí)，在具有肺炎、呼吸或腎臟衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥的中國患者中，69%的人攜帶rsl2252-CC基因型，而在病癥輕微的患者中，只有25%的人攜帶這一遺傳突變。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，rsl2252-CC基因型與CT/TT基因型相比，發(fā)生嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)增加了6倍。因此，IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性在流感的發(fā)生中起著非常重要的作用。[0018]本發(fā)明還提供鑒定與人類重癥流感相關(guān)的SNP標(biāo)記的方法，所述SNP標(biāo)記位于IFITM3-rsl2252基因如SEQIDNO.1所示序列的142bp處，此處堿基為C的個體發(fā)生重癥流感的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于此處堿基為T的個體。[0019]所述方法包括如下步驟：1)提取待測個體的基因組DNA;2)以待測個體的基因組DNA為模板，利用所述特異性引物（F和R)和探針（PR0B-T和PR0B-C)，采用Taqman熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)，根據(jù)擴(kuò)增曲線結(jié)果判定待測個體IFITM3-rsl2252基因型。具體為：擴(kuò)增曲線僅有IFITM3-rsl2252PR0B-T探針起跳，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為TT型,若擴(kuò)增曲線僅有IFITM3-rsl2252PR0B-C起跳，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為CC型，若檢測結(jié)果出現(xiàn)兩條擴(kuò)增曲線，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為雜合CT型。[0020]實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μ1計(jì)為：[0021][0022]所述緩沖液混合物中含600mM三羥甲基氨基甲烷硫酸鹽（pH8.9)，180mM(NH4)2S04，20mMdGTP，2mMdATP，2mMdTTP，2mMdCTP，耐熱性accuprimeTM蛋白（Thermostableaccuprimeprotein),10%甘油。[0023]實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)使用的條件為：95°C10分鐘；95°C15秒，60.9°C60秒，共40個循環(huán)，在循環(huán)的第二步開始收集熒光。[0024]本發(fā)明采用Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測流感易感人群的基因型，根據(jù)基因型檢測結(jié)果，對流感重癥的出現(xiàn)進(jìn)行預(yù)警，為控制流感重癥的發(fā)生提供了可能。另外，本發(fā)明提供的基因型檢測方法，為閉管式檢測，具有簡單、精確，污染性小，迅速快捷等優(yōu)點(diǎn)，適于基層推廣使用?！靖綀D說明】[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中采用Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測待測個體IFITM3-rsl2252基因型為TT型的擴(kuò)增曲線結(jié)果。[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中采用Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測待測個體IFITM3-rsl2252基因型為CC型的擴(kuò)增曲線結(jié)果。[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中采用Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測待測個體IFITM3-rsl2252基因型為雜合CT型的擴(kuò)增曲線結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】[0028]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。[0029]實(shí)施例1用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3_rsl2252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針的獲得[0030]根據(jù)IFITM3_rsl2252基因序列（SEQIDNO.1)設(shè)計(jì)并合成Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，包括：[0031]正向引物F:5'-CTGTTGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；[0032]反向引物R:5，-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3，；[0033]PROB-T:5,-FAM-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-TAMRA-3,；[0034]PROB-C:5，-HEX-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-TAMRA-3，。[0035]實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μ1計(jì)為：[0036][0037]所述緩沖液混合物中含600禮，三羥甲基氨基甲烷硫酸鹽（ρΗ8.9)，180mM(NH4)2S04,20mMdGTP，2mMdATP，2mMdTTP，2mMdCTP，耐熱性accuprime?蛋白(Thermostableaccuprimeprotein),10%甘油。[0038]實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)使用的條件為：95°C10分鐘；95°C15秒，60.9°C60秒，共40個循環(huán)，在循環(huán)的第二步開始收集熒光。[0039]人基因組DNA的提取使用DNeasyBlood&TissueKit試劑盒(購自Qiagen公司）。[0040]利用引物F和R擴(kuò)增出位于IFITM3-rsl2252基因序列142bp處的SNP位點(diǎn)，該處堿基可以為C或T，當(dāng)該處堿基為T時(shí)，可與探針PROB-T結(jié)合，發(fā)出FAM熒光信號；當(dāng)該處堿基為C時(shí)，可與探針PROB-C結(jié)合，發(fā)出HEX熒光信號。[0041]若擴(kuò)增曲線僅有IFITM3-rsl2252PR0B-T探針起跳，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為TT型（圖1)，若擴(kuò)增曲線僅有IFITM3-rsl2252PR0B-C起跳，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為CC型（圖2)，若檢測結(jié)果出現(xiàn)兩條擴(kuò)增曲線，則待測個體IFITM3-rsl2252基因型為雜合CT型（圖3)。[0042]實(shí)施例2IFITM3-rsl2252不同基因型與人類重癥流感的關(guān)聯(lián)分析及檢測應(yīng)用[0043]按照實(shí)施例1的方法，對50個人的基因組DNA樣品進(jìn)行TaqmanRT-PCR檢測，然后，再使用基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)一基因測序法對該50份DNA樣品進(jìn)行測序檢測。結(jié)果表明，TaqmanRT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基因測序的結(jié)果100%吻合。[0044]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3_rsl2252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，其特征在于，包括：正向引物F:5'-CTGITGAGAAACCGAAACTACTAGG-3'；反向引物R:5'-ATGTGGATCACGGTGGACGTC-3'；PROB-T:5,-Fl-CTCCTGTCAACAGTGGCCAG-Q-3，；PROB-C:5'-F2-CTCCTGTCAACAGCGGCCAG-Q-3'；其中，F(xiàn)l和F2為不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，Q為熒光淬滅基團(tuán)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于，F(xiàn)l為FAM，F(xiàn)2為HEX，Q為TAMRA。3.含有權(quán)利要求1或2所述引物和探針的用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rsl2252基因多態(tài)性的試劑盒。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測與人類重癥流感相關(guān)的IFITM3-rs12252基因多態(tài)性的Taqman熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，包括正向引物F、反向引物R，探針PROB-T和PROB-C。本發(fā)明采用Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測流感易感人群的基因型，根據(jù)基因型檢測結(jié)果，對流感重癥的出現(xiàn)進(jìn)行預(yù)警，為控制流感重癥的發(fā)生提供了可能。另外，本發(fā)明提供的基因型檢測方法，為閉管式檢測，具有簡單、精確，污染性小，迅速快捷等優(yōu)點(diǎn)，適于基層推廣使用。【IPC分類】C12Q1/68,C12N15/11【公開號】CN105018570【申請?zhí)枴緾N201410153178【發(fā)明人】李寧,趙艷,閆惠平,張永宏【申請人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院【公開日】2015年11月4日【申請日】2014年4月16日