淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光pcr快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速 檢測(cè)試劑盒，可用于淋球菌感染的早期檢測(cè)，對(duì)淋病進(jìn)行臨床輔助診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 淋病奈瑟菌（NG)簡(jiǎn)稱淋球菌，是淋病的病原菌，其惟 一的宿主就是人類。淋病是危害較大的傳染性疾病之一，以血液傳播、性傳播、一般的體液 傳播及私人用品傳播為傳播途徑，是一種古老而又常見(jiàn)的性病。淋病以泌尿生殖系統(tǒng)化膿 性感染為主要表現(xiàn)，主要發(fā)生在尿道和子宮頸粘膜，也可累及眼、咽、直腸和盆腔，可損害生 殖系統(tǒng)及全身其他器官，嚴(yán)重者可導(dǎo)致不孕不育。而且淋病感染后的潛伏期（14天以內(nèi))癥 狀不明顯，一旦過(guò)了潛伏期，就具有了明顯癥狀，若不及時(shí)診治，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的泌尿生殖疾 病等，所以應(yīng)及早對(duì)淋病進(jìn)行診斷及治療。
[0003] 近年來(lái)淋病的發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)，發(fā)病率居中國(guó)性傳播疾病首位，而且多發(fā) 于青壯年。此外，淋球菌感染可增加艾滋病感染的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)5倍以上。因此，淋病不僅嚴(yán)重危 害患者的身心健康，而且影響了社會(huì)的穩(wěn)定及精神文明建設(shè)，所以做好淋病的防治工作具 有重大的意義。而淋病的防治的關(guān)鍵在于NG感染的早期診斷，只有對(duì)可疑患者進(jìn)行及時(shí)的 診斷，才能有效的治療和預(yù)防淋病。
[0004] 臨床上對(duì)于淋病的確診主要依靠 NG的檢測(cè)結(jié)果，而臨床檢測(cè)方法一般常用是直 接涂片染色法、分離培養(yǎng)法、快速檢測(cè)法及抗原檢測(cè)等等，但是這幾種方法在敏感性和特異 性上都有不足，容易漏檢。近年發(fā)展起來(lái)的PCR方法則具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，且簡(jiǎn)便省 時(shí)等特點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于臨床樣本的輔助診斷，尤其是在原普通PCR的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來(lái)的實(shí) 時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的 全過(guò)程可以再單管內(nèi)封閉完成，并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié) 果，避免了 PCR后的處理，是一種先進(jìn)的分子定量檢測(cè)技術(shù)。
[0005] 目前市場(chǎng)已出現(xiàn)了多家以熒光PCR為基礎(chǔ)的NG診斷試劑盒，例如中山大學(xué)達(dá)安基 因股份有限公司，凱杰生物工程（深圳）有限公司，上海之江生物科技有限公司等。但是大 多以熒光探針?lè)橹鳎捎谝M(jìn)行熒光物質(zhì)和淬滅物質(zhì)雙重標(biāo)記，使得探針合成成本比較 高，影響其市場(chǎng)推廣以及病人承受能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、檢測(cè)成本低的淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速 檢測(cè)試劑盒。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR快 速檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品、裂解液及蛋白酶 K溶液；PCR反應(yīng)液中包含了針對(duì)淋病奈瑟氏菌特異序列設(shè)計(jì)的正向引物、反向引物和SYBR Green I 染料； 正向引物序列為：5'_ ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物序列為：5'_ GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 裂解液包含 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、0· 2mM EDTA(pH8. 0)、 l%(V/V)TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20 ； 陽(yáng)性質(zhì)控品與弱陽(yáng)性質(zhì)控品是含插入淋病奈瑟氏菌特異性保守序列的PCR2. I載體質(zhì) 粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中增殖后經(jīng)提取純化、用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純 度后用無(wú)菌TE緩沖液定量稀釋；陰性質(zhì)控品是滅菌去離子水。
[0008] PCR反應(yīng)液還包含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種核苷酸。
[0009] 上述正向引物、反向引物的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述衍生序列包括 引物序列的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5'端和3'方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一至數(shù)個(gè) 喊基得到的序列。
[0010] 本試劑盒保存于-20°c以下，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明即淋病奈瑟菌實(shí)時(shí)熒光 PCR快速檢測(cè)試劑盒，用于臨床樣本中淋病奈瑟氏菌的快速檢測(cè)，用于淋球菌感染的早期檢 測(cè)，用于淋病奈瑟氏菌感染的輔助診斷。
[0011] 本發(fā)明針對(duì)淋病奈瑟氏菌特異性基因保守序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，能特異性擴(kuò) 增靶DNA序列，從而達(dá)到臨床診斷目的，可以簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)臨床樣本中淋病奈瑟氏菌感 染，具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明與其它檢測(cè)技術(shù)相比主要具備以下優(yōu)點(diǎn)： 1、 相對(duì)于常規(guī)PCR技術(shù)，本產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果明了等特點(diǎn)產(chǎn)物不要凝膠電泳檢 測(cè)，完全閉管操作，有效的減低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)； 2、 對(duì)于探針?lè)晒釶CR技術(shù)，本產(chǎn)品采用SYBR Green染料法，價(jià)格低廉，有效 地降低了生產(chǎn)成本； 3、 檢測(cè)速度快，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作僅需2-3個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)單； 4、 用于淋球菌感染的早期檢測(cè)，盡早診斷治療。
[0012] 總之，本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、快速明了、價(jià)格低廉等 優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)閉管操作，減少后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物帶來(lái)的污染的可能性，是一種適用于臨床樣本中淋 病奈瑟氏菌的快速檢測(cè)的試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是淋病奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表 示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，S1-S6分別表示濃度為5. OXlO4c0Pies/ μ 1>5. OX IO3Copies/ μ 1>5. OX IO2Copies/ μ 1>5. OX IOcopies/ μ 1>5. Ocopies/ μ 1> 5. OX 10 kopies/y 1的陽(yáng)性指控品的擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，CK為陰性質(zhì)控品； 圖2是淋病奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循 環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，A代表NG陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表特異性參考品擴(kuò)增 曲線和陰性指控品擴(kuò)增曲線，特異性參考品分別為大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克 雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌與沙眼衣原體； 圖3是淋病奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒的陰性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán) 數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，A代表NG陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表20個(gè)無(wú)菌去離子重 復(fù)樣本的擴(kuò)增曲線； 圖4是淋病奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循 環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，SO為10份濃度為5. OX IO5Copies/μ 1的陽(yáng)性參考品擴(kuò) 增曲線，S4為10份濃度為5.0X10C〇pies/l·! 1的陽(yáng)性參考品擴(kuò)增曲線，CK代表陰性質(zhì)控 品； 圖5是淋病奈瑟氏菌檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循 環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，S5為20份濃度為5. Ocopies/ μ 1的NG陽(yáng)性參考品擴(kuò)增 曲線，CK表示陰性質(zhì)控品。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 本試劑盒采用SYBR Green染料法熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，快速檢測(cè)臨床樣品中淋球菌 特有序列，從而判斷淋球菌的存在。對(duì)保守序列我們共設(shè)計(jì)多對(duì)引物，并對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證，最后選擇了靈敏度高、特異性好的一對(duì)引物。下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)方法和條件可 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或按照試劑制造商說(shuō)明書(shū)中所建議的步驟和條件。
[0015] 實(shí)施例1試劑盒的制備 1、 試劑盒特異性引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)網(wǎng)上公布的NG序列（GenBank :AJ223446. 1)，針對(duì)淋球菌保守基因 PorA片段利用 生物學(xué)軟件Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件對(duì)淋球菌PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且用 軟件Mega4和NCBI在線Blast進(jìn)行序列比對(duì)，保證每對(duì)引物特異性和合理性。引物委托寶 生物工程(大連）有限公司合成，采用PAGE純化，試劑盒特異性引物核苷酸序列如下： 正向引物：5'- ACCGAGCCACCCTCAGACT-3'， 反向引物：5'- GCCCAAATCCCCACCTT-3'， 2、 NG質(zhì)粒陽(yáng)性質(zhì)控品的設(shè)計(jì)與制備 在上述NG特異性引物擴(kuò)增序列的外圍序列，重新設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，該引物擴(kuò)增片段 能完全覆蓋住設(shè)計(jì)的NG特異性引物擴(kuò)增區(qū)域。該外圍引物委托寶生物工程(大連）有限公 司合成，采用PAGE純化，該外圍引物核苷酸序列如下： 正向引物：5' -AACTTACCGCCCTCGTATTGTC-3'， 反向引物：5' -CCACATTATTATTGCTGTCCCA-3'， 采用該引物擴(kuò)增的特異性核苷酸序列為： 5'-AACTTACCGCCCTCGTATTGTCCGCACTGCCGTTTGCGGCAGTTGCCGATGTCGGCCTGTACGGCGAAG TCAAAGCTGGTGTGGAAGGCAGGAACATCCGGCTGCAGTTGACCGAGCCACCCTCAGACTGTCAAACGGGCAATACA GTTACTAAGGCCAAAAGCCGCATCAGGACGAAAGTCAGTGATTTCGGCTCGTTTATCGGCTTTAAGTTGGTGGGGAT TTGGGCGGCGGGCTGAAGGCTGTTTGGCAGCTCGAGCAAGACGTATCCGTTGCCGGCGGCGGCGCGACCCGTTGGGG TAACAGGGAATCCTTTATCGGCTTGGCAGGCGAATTCGGCACGGCGCTCGCCGGTCGCGTTGCGAATCCGTTTGGCG ATGCCAGCAAAGCCATTGATCCTTGGGACAGCAATAATAATGTGG-3' 422bp 〇
[0016] 利用上述外圍引物和NG臨床陽(yáng)性樣本DNA裂解液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn) 物純化后連接到質(zhì)粒PCR2. 1載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白 斑初篩后，再經(jīng)過(guò)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，經(jīng)雙向DNA 測(cè)序鑒定后，作為陽(yáng)性質(zhì)控品的制備原料。
[0017] 質(zhì)粒pCR2. 1載體通過(guò)商業(yè)途徑獲得，購(gòu)自于Invitrogen公司；大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞通過(guò)商業(yè)途徑獲得，購(gòu)自于TAKARA公司。
[0018] 3、質(zhì)控品的制備 陽(yáng)性質(zhì)控品由陽(yáng)性質(zhì)控品的制備原料、采用TE緩沖液稀釋制備；陽(yáng)性質(zhì)控品采用濃度 為1.0 X IO6C