微藻紅樹林裂殖壺菌的生物質以及用于制備它的方法
【專利說明】微藻紅樹林裂殖壺菌的生物質以及用于制備它的方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種微藻的生物質，其富含二十二碳六烯酸（或DHA)，富含棕櫚酸以 及富含磷脂，特別是磷脂酰膽堿、破囊壺菌屬的微藻生物質，更特別是裂殖壺菌，在這種情 況下是紅樹林裂殖壺菌（Schizochytrium mangrovei)特定菌株的生物質。
[0002] 脂類與蛋白質和碳水化合物一起構成了大量營養(yǎng)元素的三個主要家族。
[0003] 在脂類中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出：
[0004]-甘油三酸脂（也稱為三酰甘油酯或三酸甘油酯或TAGs)是甘油酯，其中甘油的三 個羥基被脂肪酸酯化。它們是植物油與動物脂肪的主要成分。
[0005] 甘油三酸脂代表了被人類攝取的大致95%的飲食脂肪。在體內(nèi)，它們主要存在于 脂肪組織并構成了能量存儲的主要形式。
[0006] _磷脂是兩親性脂類，即脂類由一個極性（親水性）"頭"和兩個脂肪族的（疏水 性）"尾巴"組成。
[0007] 磷脂是結構性脂質，因為他們是細胞膜的組分，在細胞膜中它們尤其提供流動性。
[0008] 大多數(shù)的磷脂是磷酸甘油酯，其頭部被用極性分子酯化的甘油-3-磷酸殘基圍 繞，并且兩條尾巴是兩個脂肪酸的脂肪鏈。
[0009]另一種磷脂是鞘磷脂，其結構上衍生自鞘氨醇并非衍生自甘油，鞘氨醇構成兩條 脂肪族的尾巴之一。
[0010] 分離自活體組織的第一種磷脂從蛋黃卵磷脂中得以表征-它們更具體是磷脂酰 膽堿。此外，這就是為什么磷脂酰膽堿又稱卵磷脂。
[0011] 磷脂酰膽堿由肝臟自然產(chǎn)生。它們是膽汁的重要成分，其中它們?nèi)榛嬖谟谑?指腸中的脂肪。除了膽鹽之外，對于防止脂滴重新凝集，它們也是必要的。
[0012] 作為磷脂，磷脂酰膽堿參與到細胞膜中并且用來保存它們的粘彈性。它們是神經(jīng) 系統(tǒng)的必要成分并且構成了腦的近30%干重和15%的神經(jīng)。
[0013] 甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸組成，這些脂肪酸都是由飲食提供，并且對于它 們中的一些，是由生物合成的。
[0014] 生物化學分類（基于脂肪酸分子中包含的雙鍵數(shù)量）區(qū)分飽和脂肪酸（SFA)、單不 飽和脂肪酸（MUFA)和多不飽和脂肪酸（PUFA)。
[0015] 從生理學角度，區(qū)分為以下內(nèi)容：
[0016]-必需脂肪酸，人體成長和正常運行所必需的，但我們身體不能夠產(chǎn)生；
[0017]條件性"必需脂肪酸，其對于細胞正常生長和生理功能是必要的，但如果通過飲 食提供的話，其可以從它們的前體中產(chǎn)生。因此，如果它們必需的前體不存在，它們是嚴格 必需的。
[0018]-非必需脂肪酸。
[0019] 必需脂肪酸和"條件性"必需脂肪酸的組組成了必要脂肪酸。
[0020] 其它脂肪酸稱為非必要脂肪酸。
[0021] 在非必需脂肪酸中，尤其是：
[0022] _ ? 3脂肪酸家族的二十碳五烯酸（EPA)，
[0023]-油酸，在我們飲食中的主要的單不飽和脂肪酸，以及
[0024]-飽和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸或棕櫚酸。
[0025] 多不飽和脂肪酸是根據(jù)第一雙鍵的位置（從最終甲基官能起始）歸類的。
[0026] 因此，在命名中對于《 "x"或"nx"，"x"對應于第一不飽和的位置。
[0027]區(qū)分必要脂肪酸的兩個主要家族：脂肪酸（或n-6PUFA)，其前體和主要代表是 亞油酸（LA);以及《 3脂肪酸（或n-3PUFA)，其前體是a -亞麻酸（ALA)。
[0028] 生物學上感興趣的多不飽和脂肪酸的大部分屬于家族（花生四烯酸或ARA) 或《 3家族（二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)。
[0029] 此外，在命名中，構成鏈的碳原子數(shù)也被定義：從而EPA被描述為C20:5并且DHA 被描述為C22:6。
[0030] 因此該"5"和"6"對應于碳鏈的不飽和數(shù)目，該碳鏈分別由EPA和DHA表示。
[0031] w 3脂肪酸家族的DHA是生物可以從a -亞麻酸合成的或通過消耗富含油脂的魚 (金槍魚、鮭魚、鯡魚等）提供的一種脂肪酸。
[0032] DHA在膜結構以及腦的和視網(wǎng)膜的發(fā)育和功能中發(fā)揮了重要作用。
[0033] 魚油主要用作《 3脂肪酸例如DHA和EPA的來源，但《 3脂肪酸也發(fā)現(xiàn)于微藻油， 其中它們是作為一種混合物或分開地進行提取，如在這種情況下，例如這些油衍生自某些 選擇的菌株，例如裂殖壺菌屬的那些，其僅包含痕量的EPA，但包含高DHA含量。
[0034] 可獲得富含DHA的微藻生物質的商業(yè)制品。
[0035] 例如，可以由此提到的是：
[0036]-建議用于在輪蟲水產(chǎn)養(yǎng)殖中的營養(yǎng)，Algamac系列產(chǎn)品，由阿卡福納生物海洋公 司(AquafaunaBio-MarineInc)銷售，或
[0037]-由DSM公司以商標名DHAGold?銷售的產(chǎn)品。
[0038] 然而，仍需要提供有以下品質的微藻生物質：具有高DHA含量，并且具有長鏈飽和 或多不飽和脂肪酸的以及磷脂的完全特定譜。
[0039] 首先，本申請公司的榮譽在于提供了一種富含DHA的微藻的新穎生物質，該生物 質具有：
[0040] -除DHA以外的低含量的多不飽和脂肪酸（例如EPA)，
[0041] -有限含量的某些長鏈飽和脂肪酸（例如肉豆蔻酸和月桂酸）。
[0042] _高含量的磷脂（高達兩倍于商業(yè)制品中常見的數(shù)量），更具體的是磷脂酰膽堿。
[0043] 同樣，急于研發(fā)一種比現(xiàn)有技術中描述的那些更有效且便宜得多的生產(chǎn)方法，在 其研宄過程中，本申請公司已經(jīng)鑒定了一種生產(chǎn)DHA并且具有以下各項生產(chǎn)特性的紅樹林 裂殖壺菌的新穎菌株：
[0044]-極少的高膽固醇的飽和脂肪酸（少于6%的月桂酸和肉豆蔻酸，這些是本領域技 術人員知道的已知的最高膽固醇的），
[0045]-多于40%的棕櫚酸，
[0046](在此％應理解為按總脂肪酸的重量計）。
[0047] 棕櫚酸的也稱十六烷酸或鯨蠟酸，是在動物和植物中最常見的C16:0飽和脂肪酸 之一。
[0048] 在脂肪生成過程中，棕櫚酸是產(chǎn)生的第一種脂肪酸，較長的脂肪酸可以從所述的 棕櫚酸產(chǎn)生。
[0049] 此外，脂肪酸被優(yōu)先用于合成ATP。其燃燒的能量平衡表示為129個ATP。因此， 它構成了一種優(yōu)秀的能量食品
[0050] 在工業(yè)上，棕櫚酸還被用于人造黃油和肥皂的生產(chǎn)。
[0051] 在涂料領域，鑒于棕櫚酸是飽和的，它不能聚合并且一旦與大氣中的氧氣接觸它 就變得堅硬（不像油酸、亞油酸和亞麻酸）。因此，它仍處于其軟固體形式并且作（與硬脂 酸）為一種用于聚合油粘合劑的增塑劑。因此，與硬脂酸一起，它針對隨時間推移的含油圖 片材料的完好保存提供了所需的彈性。
[0052] 此外，根據(jù)本發(fā)明的紅樹林裂殖壺菌生物質具有：
[0053]-在1. 5%和2%之間的磷脂含量，其中的1 %至1. 3%由磷脂酰膽堿組成，
[0054]-如NX6. 25表示的在10%和20%之間的一個總氨基酸含量，
[0055](在此％應理解為按相對于處于99%干物質的100g生物質的重量計）。
[0056] 這種紅樹林裂殖壺菌菌株于2012年11月22日存放在法國巴斯德研宄所的法國 微生物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures] (CNCM)，法國，巴黎 市，郵政編碼75724,15號信箱，du docteur Roux街25號，在編號CNCM 1-4702下。
[0057] 它以測序編碼18 S rRNA的基因來表征：
[0058] 1 GGTTTTACAT TGCTCTCATT CCGATAGCAA AACGCATACA CGCTTCGCAT CGATATTTCT
[0059] 61 CGTCCTACCT CGTGGAGTCC ACAGTGGGTA ATTTACGCGC CTGCTGCTAT CCTTGGATAT
[0060] 121 GGTAGCCGTC TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA GTCGAGCCCT AACTCTCCGT CACCCGTTAT
[0061] 181 AGTCACCGTA GTCCAATACA CTACCGTCGA CAACTGATGG GGCAGAAACT CAAACGATTC
[0062] 241 ATCGACCAAA AWAGTCAATC TGCTCAATTA TCATGATTCA CCAATAAAAT CGGCTTCAAT
[0063] 301 CTAATAAGTG CAGCCCCATA CAGGGCTCTT ACAGCATGTA TTATTTCCAG AATTACTGCA
[0064] 361 GGTATCCATA TAAAAGAAAC TACCGAAGAA ATTATTACTG ATATAATGAG CCGTTCGCAG
[0065] 421 TCTCACAGTA CAATCGCTTA TACTTACACA GCAG(SEQ ID No 1)
[0066] 該序列可以鑒定其為紅樹林裂殖壺菌型的一個菌株。
[0067] 因此，本發(fā)明涉及2012年11月22日保藏于CNCM編號1-4702下的紅樹林裂殖壺 菌菌株。
[0068] 在本申請中這種菌株隨后可以被表示為"CNCM 1-4702"。
[0069] 本發(fā)明還涉及這種菌株的變體或涉及衍生自其的菌株，所述變體或所述衍生菌株 保留了生產(chǎn)高含量DHA和棕櫚酸的性質。
[0070] 具體而言，它涉及了通過誘變或通過基因轉化從CNCM 1-4702菌株獲得的紅樹林 裂殖壺菌菌株。該誘變可以是定位誘變和/或隨機誘變。這種菌株保留了生產(chǎn)高含量的DHA 和棕櫚酸的性質。具體來說，特別是當它在實例1中所描述的條件下進行培養(yǎng)時，它能夠產(chǎn) 生多于35 %的DHA和多于40 %的棕櫚酸，這兩個％按總脂肪酸的重量計來表示。此外，它 產(chǎn)生了按處于99%干物質的生物質的重量計表示的在1%和1. 3%之間的磷脂酰膽堿。
[0071] 本發(fā)明還涉及制備此類菌株的方法，該方法包括CNCM 1-4702菌株的誘變或基因 轉化以及可任選地，一個用于對生產(chǎn)以下各項的菌株進行選擇的篩選步驟：
[0072] -多于 35% 的 DHA，
[0073]-多于40%的棕櫚酸，
[0074](這兩個％按總脂肪酸的重量計來表示），
[0075]-在1%和1. 3%之間的磷脂酰膽堿，
[0076](該％按處于99%干物質的生物質的重量計來表示）。
[0077] 本發(fā)明涉及培養(yǎng)CNCM 1-4702菌株或其保留了生產(chǎn)DHA和棕櫚酸能力的變體的方 法，該方法包括在適當?shù)慕橘|和合適的發(fā)酵條件下培養(yǎng)這種菌株的步驟。
[0078] 此外，本發(fā)明涉及用于制備紅樹林裂殖壺菌的生物質的方法，其特征在于它通過 以下步驟的順序進行制備：
[0079] 〇在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)該菌株以便生產(chǎn)一種生物質，該生物質具有按總脂肪酸的重 量計表示的在35 %和40 %之間的DHA，按總脂肪酸的重量計表示的在40 %和50wt %之間的 棕櫚酸，以及在1%和1. 3%之間的磷脂酰膽堿，％按生物質的重量計來表示，
[0080] 。收集由此制備的該生物質
[0081] 。干燥所述生物質。
[0082] 在異養(yǎng)條件下進行該培養(yǎng)?？偟膩碇v，該培養(yǎng)步驟包括預培養(yǎng)步驟（為了使該菌 株復蘇），然后是適當?shù)呐囵B(yǎng)或發(fā)酵步驟。后一步驟相對應于生產(chǎn)感興趣的脂類化合物的步 驟。
[0083] 申請公司推薦對CNCM 1-4702菌株采取三步驟需氧發(fā)酵，如將在下文中舉例說明 的。
[0084] 在前面的預培養(yǎng)步驟之后，三步發(fā)酵步驟是以在一種介質中培養(yǎng)CNCM 1-4702菌 株為特征，在該介質中碳源的提供是根據(jù)由微生物消耗的葡萄糖來調節(jié)。