一種谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酰胺酰基環(huán)化酶（Glutaminyl cyclase，QC，EC2. 3. 2. 5)是一種可以催化多 肽、蛋白等N端谷氨酰胺殘基分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)生成焦谷氨酸（pGlu)的酶，具有改變蛋白等 N端化學(xué)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)活性、增強(qiáng)穩(wěn)定性等重要生物學(xué)功能。
[0003] 1963年，QC首次在熱帶植物番木瓜（Carica papaya)乳膠中發(fā)現(xiàn)，后研宄證實(shí)， QC在植物、動(dòng)物、微生物中均有分布。但在植物中，QC的生理功能并不十分明確，可能在植 物防御病原微生物過程中有一定的作用。植物、動(dòng)物中的QC酶動(dòng)力學(xué)行為均符合米氏方程 (Mechaelis-Menten)，且對(duì)底物N端部位L-谷氨酰胺具有嚴(yán)格的特異性。哺乳動(dòng)物QC具 有高度保守性，與番木瓜QC之間沒有任何序列同源性，而與細(xì)菌氨肽酶具有顯著的序列同 源性，故動(dòng)物和植物QC具有不同的進(jìn)化起源。
[0004] 隨著人類社會(huì)年齡結(jié)構(gòu)老齡化的不斷發(fā)展，老年癡呆發(fā)病率迅速升高。阿爾茨海 默?。ˋlzheimer' s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆的主要形式， 流行病學(xué)調(diào)查顯示，AD患者超過老年癡呆患者總數(shù)的65%以上。日前，AD發(fā)病率日趨升高， 已成為僅次于心腦血管疾病和腫瘤的第三大世界性健康問題。
[0005] AD主要臨床癥狀包括進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙等，目前尚無(wú)特效治療藥物。AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，經(jīng)過一百多年的研宄，人們提出了一些不同的假設(shè)，如AD相關(guān)蛋白質(zhì)的纏 結(jié)及聚集、氧化應(yīng)激、生物金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體功能衰竭等，然而，確切機(jī)理并不明 了。AD病理學(xué)特征主要是腦部神經(jīng)元外部的β -淀粉樣蛋白沉淀和神經(jīng)元內(nèi)部的過度磷酸 化Tau蛋白纏結(jié)等。β-淀粉樣蛋白（Αβ)是老年斑的主要成分，根據(jù)Αβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)，Αβ 的過量產(chǎn)生和聚集、沉淀被認(rèn)為與AD發(fā)病及進(jìn)展有直接關(guān)系。Αβ是β-淀粉樣前體蛋白 (APP)經(jīng)β -分泌酶和γ -分泌酶水解所得片段產(chǎn)物，如A β 42/Α β 40。體外研宄等顯示， Αβ過量表達(dá)和聚集、沉淀可以直接導(dǎo)致線粒體紊亂、氧化應(yīng)激、神經(jīng)突觸傳遞中斷、軸突運(yùn) 輸中斷、膜完整性受損破裂等多種AD相關(guān)病理變化。
[0006] 近年，多項(xiàng)體內(nèi)和臨床研宄共同證實(shí)，區(qū)別于正常老年人腦部的老年斑沉淀，AD患 者腦部老年斑沉淀的主要成分并非A β蛋白，而是多種變異的A β蛋白，特別是N端3-位 谷氨酰胺殘基分子內(nèi)環(huán)合的PGlu-A β，包括pGlu-A β 42/pGlu-A β 40，含量超過50 %。 pGlu-Αβ具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性、更快的聚集沉淀速度、更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，且其產(chǎn)生與AD臨床 癥狀的廣生直接相關(guān)。這為AD相關(guān)研宄提供了新的線索。相關(guān)研宄的進(jìn)一步株入表明， pGlu-Αβ是QC作用的產(chǎn)物。QC特異性高表達(dá)是AD發(fā)病早期的特異性病變，是AD發(fā)病、發(fā) 展的關(guān)鍵促進(jìn)因素，選擇性抑制QC活性可顯著抑制pGlu-A β的產(chǎn)生和老年斑沉淀的形成， 并明顯改善認(rèn)知、記憶功能損傷等AD癥狀。因此，QC為AD病理及病因性創(chuàng)新抗AD藥物研 宄開啟了新的研宄方向。
[0007] QC酶蛋白是相關(guān)研宄的必須原材料，其品質(zhì)對(duì)QC作用機(jī)制和抑制劑研宄具有重 要影響。QC的獲得可通過天然物中活性QC的分離制備和采用基因工程技術(shù)制備重組QC兩 種方法實(shí)現(xiàn)。提取分離方法受天然物中QC含量較低、提取成本高、批次穩(wěn)定性差、酶活性損 失嚴(yán)重等不足，在推廣應(yīng)用方面有較大的限制。相比之下，基因工程技術(shù)制備重組QC是較 容易實(shí)現(xiàn)的一種活性QC制備方法。目前，已有報(bào)道稱可通過E. coli表達(dá)制備重組QC，但 方法上存在一定缺陷，制備表達(dá)量低、酶活性差、步驟繁多等?？梢?，一種新的，可高效、快捷 制備高活性重組人QC的方法的建立，對(duì)QC相關(guān)機(jī)理研宄、QC抑制劑類抗AD新藥研宄及QC 表達(dá)異常相關(guān)疾病臨床診斷等都具有極為重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種谷氨酰胺酰基環(huán)化酶的制 備方法，提供一種新的可以高效、快捷制備高活性人谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備途徑。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，包括以下步驟：
[0011] a、將可用于表達(dá)QC33_361的重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得可合成 QC33^361的基因工程菌；
[0012] b、將基因工程菌接種到含有抗性標(biāo)記的LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)；
[0013] c、誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體，溶菌、高壓破碎菌體，離心分離，取上清液進(jìn)行親和 層析進(jìn)行純化，收集含有qc33_ 361的融合蛋白；
[0014] d、對(duì)含有QC33_361的融合蛋白進(jìn)行PPE酶，脫鹽，分子篩柱層析純化，分離出QC 33_361 蛋白。
[0015] 所述的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶的制備方法，其中，步驟b中，包括以下步驟：
[0016] 挑取基因工程菌單菌落接種到接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)， 得到種子培養(yǎng)液；
[0017] 將種子培養(yǎng)液接種到含有抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C，振搖培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600值 達(dá)到0. 6-0. 8,以IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0018] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，步驟c中，包括以下步驟：
[0019] 將菌液離心收集菌體，使用高壓破碎細(xì)胞儀裂充分裂解菌體，離心，上清液用Ni 離子親和層析進(jìn)行分離純化，收集含有QC33_361的融合蛋白。
[0020] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，步驟d中，包括以下步驟：
[0021] 用脫鹽柱對(duì)收集所得融合蛋白脫鹽，用PPE酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切，用分子篩 S-200Column對(duì)酶切混合體系進(jìn)行分子篩柱層析純化，收集目的蛋白QC33_361。
[0022] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，步驟a中，包括以下步驟：
[0023] 在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入可用于表達(dá)QC33_361的重組載體，冰上靜置，水溶鍋 熱激60-70S，冰上靜置，加入適量的LB液體培養(yǎng)基，涂布到帶有抗性標(biāo)記的LB固體平板上， 培養(yǎng)過夜，得到基因工程菌。
[0024] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，步驟a中，所述大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞為大腸桿菌DH5a或者大腸桿菌BL21(DE3)。
[0025] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，步驟a中，在轉(zhuǎn)化重組載體前，對(duì) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行活化處理：
[0026] 將保存的菌種活化，在LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至0D600值為0. 6~0. 8,冰上 使菌液冷卻至〇°C，離心收集菌體，以預(yù)冷的0. lmol/L 0&(：12溶液制備感受態(tài)細(xì)胞。
[0027] 所述的谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，其中，所述用于表達(dá)QC33_361的重組載體 的制備方法，包括以下步驟：
[0028] 采用PCR技術(shù)，以上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2為引物對(duì)，擴(kuò)增 得到QC33_361基因片段；其中，上游引物為5' -ACCTGGATCCGCTTCTGCTTGGCCGG-3' ；下游引物 為 5' -TATCCTCGAGTTACAGGTGCAGGTATTC-3' ；
[0029] 對(duì)載體pET28a和pET32a，分別進(jìn)行EcoRI、XhoI雙酶切；將兩端同樣存在EcoRI、 XhoI位點(diǎn)的線性化載體進(jìn)行連接，獲得改造后的pET32a載體；
[0030] 對(duì)QC33_361基因片段和改造后的pET32a載體進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切，將兩端同 樣存在BamHI、Xho I位點(diǎn)的QC33_361基因片段和線性化載體進(jìn)行連接，獲得pET32a/QC 33_361重 組載體。
[0031] 有益效果：本發(fā)明提供一種用于表達(dá)人谷氨酰胺?；h(huán)化酶的重組載體，可用于 高效、快捷制備高活性重組人qc 33_361酶。將該載體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中，可用于合成人谷氨酰 胺?；h(huán)化酶。合成得到的人谷氨酰胺?；h(huán)化酶qc 33_361為具有顯著催化底物分子內(nèi)谷氨 酰胺?；h(huán)化反應(yīng)的活性，可以高效催化蛋白（多肽）N端谷氨酰胺?；姆肿觾?nèi)環(huán)合反應(yīng) 生成焦谷氨酸化的產(chǎn)物。合成得到的人谷氨酰胺?；h(huán)化酶QC 33_361可用于QC抑制劑、激動(dòng) 劑、詰抗劑等的篩選發(fā)現(xiàn)、QC相關(guān)作用機(jī)制研宄、QC檢測(cè)相關(guān)試劑盒的開發(fā)、QC尚表達(dá)相關(guān) 疾病的檢測(cè)診斷等。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1是本發(fā)明QC重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
[0033] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中QC33_361基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0034] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中重組質(zhì)粒pET32a/QC33_361的雙酶切鑒定結(jié)果。
[0035] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例4中QC33_361蛋白的表達(dá)純化過程中的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0036] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例4中所得QC33_361蛋白質(zhì)譜分析比對(duì)結(jié)果。
[0037] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例5中QC33_361酶活性測(cè)試原理示意圖
[0038] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例5中QC33_361雙倒數(shù)擬合曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本發(fā)明提供一種谷氨酰胺?；h(huán)化酶的制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案 及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施 例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0040] 本發(fā)明利用人谷氨酰胺?；h(huán)化酶QC33_361，是EC2. 3. 2. 5全長(zhǎng)蛋白的一個(gè)片段，從 GenBank檢索出人腦垂體QC的cDNA序列，結(jié)合pET32a載體的特點(diǎn)，用軟件Oligo設(shè)計(jì)一 對(duì)特異性引物，擴(kuò)增得到QC酶的基因序列，并將其插入pET32a載體上，構(gòu)建得到可以用于 表達(dá)人谷氨酰胺?；h(huán)化酶的重組載體。并且，將該載體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中，可用于合成人 谷氨酰胺酰基環(huán)化酶。合成得到的人谷氨酰胺酰基環(huán)化酶QC 33_361為具有顯著催化底物分子 內(nèi)谷氨酰胺?；h(huán)化反應(yīng)的活性，可以高效催化蛋白（多肽）N端谷氨酰胺?；姆肿觾?nèi)環(huán) 合反應(yīng)生成焦谷氨酸化的產(chǎn)物。合成得到的人谷氨酰胺?；h(huán)化酶QC33_361可用于QC抑制 劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等的篩選發(fā)現(xiàn)、QC相關(guān)作用機(jī)制研宄、QC檢測(cè)相關(guān)試劑