一種h9亞型禽流感病毒株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物獸藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種H9亞型禽流感病毒株。
【背景技術(shù)】
[0002] H9亞型禽流感屬于低致病性疫病，但與其他病原特別是大腸桿菌混合感染能夠提 高其致病力，引起產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降和死亡率顯著提高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。已有的禽 流感（H9亞型）疫苗已在臨床廣泛使用，但存在抗體水平較低和抗體整齊度方面的問(wèn)題，從 而影響到疫苗的防治效果。
[0003] 低致病H9亞型禽流感的發(fā)生是潛在性的，但也可以給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)滅頂之災(zāi)，對(duì) 人類(lèi)的威脅同樣嚴(yán)重。低致病性禽流感病毒的流行特點(diǎn)是分布極為廣泛，危害持久和難以 控制。尤其是H9N2禽流感病毒（AlV)，不僅在全世界范圍的禽類(lèi)中廣泛流行，而且可以感染 人。因此，對(duì)H9N2A1V的研宄工作也非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種H9亞型禽流感病毒株；并用該病毒株來(lái)制備疫苗，從而 克服由于該新型病毒導(dǎo)致已有的H9亞型禽流感病毒疫苗免疫效果不好的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒QDY株（Avian influenza virus)，已于2015年4月 29日保藏于武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:V201517。
[0006] 本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒QDY株用于制備疫苗
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)方面還提供一種H9亞型禽流感病毒滅活疫苗，包括抗原和疫苗佐 劑，其所用的抗原為滅活的H9亞型禽流感病毒QDY株。
[0008] 其中的H9亞型禽流感病毒株經(jīng)過(guò)甲醛溶液滅活后作為抗原備用；
[0009] 上述的疫苗中H9亞型禽流感病毒的含量不低于為106_°EID5(l/0. 3ml。
[0010] 本發(fā)明將H9亞型禽流感病毒（QDY株），接種雞胚后收取病毒液，經(jīng)超濾濃縮、甲醛 溶液滅活后加油佐劑混合乳化制成疫苗。本發(fā)明制備的疫苗能提高免疫后的抗體水平，提 高免疫后抗體的整齊度，保證了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 本發(fā)明篩選出效價(jià)高、免疫原性好的禽流感毒株（QDY株）經(jīng)滅活后作為抗原，加 入油佐劑，制備了新型的禽流感病毒滅活疫苗。
[0012] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。本發(fā)明所應(yīng)用的方法可以采用疫 苗制備領(lǐng)域中常用的方法，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。
[0013] 實(shí)施例1、制苗用抗原毒株（H9亞型禽流感病毒QDY株）的篩選
[0014] 2013年從山東城陽(yáng)地區(qū)已接種了 H9亞型禽流感病毒疫苗的發(fā)病雞群中，無(wú)菌采 集發(fā)病雞的心、脾等臟器和喉頭、泄殖腔拭子，滅菌平皿中無(wú)菌條件下進(jìn)行研碎，按1:5的 比例加入含4000單位/ml雙抗的生理鹽水，于-20°C反復(fù)凍融3次。棉拭子直接放入含1 萬(wàn)單位雙抗的生理鹽水中，2~8°C作用4h，臟器及棉拭子均3500rpm離心10min，取上清， 混合后接種10日齡的SPF雞胚5枚，0. 2ml/枚。雞胚置37°C孵育，每天早晚各照檢一次， 及時(shí)取出死胚置4°C冰箱中保存，棄去24h內(nèi)的死亡胚，至96h時(shí)取出全部雞胚。逐胚收集 雞胚尿囊液，血凝試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià)，連續(xù)傳代3次。收獲的病毒液經(jīng)純化后進(jìn)行了病毒含 量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測(cè)，結(jié)果表明該毒株病毒含量為 10 8_9EID5tlA). Iml，該病毒僅與H9亞型禽流感病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，無(wú)細(xì)菌、支原體及外源病 毒污染，適合作為制苗用毒株。
[0015] 將篩選QDY株保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所 的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No !M201517。
[0016] 對(duì)篩選的QDY株的基因 HA進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果HA全長(zhǎng)為1683bp，編碼560個(gè)氨基酸； NCBI的blast序列分析表明，QDY株的結(jié)構(gòu)基因 HA與已公開(kāi)的禽流感病毒的HA存在差異 位點(diǎn)，同源性為97. 5%~98. 8%;表明本發(fā)明所篩選的QDY株為一新型的H9亞型禽流感病 毒株。
[0017] 為了檢測(cè)上述氨基酸的差異對(duì)QDY株抗原性的影響，用其來(lái)制備抗原來(lái)檢測(cè)其免 疫原性。
[0018] 實(shí)施例2 :制苗用抗原的制備
[0019] L制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種（QDY株）經(jīng)尿囊腔接種10~11日齡SPF 雞胚，每胚0. 2ml，36°C~37°C孵育，每日照胚2次，取24小時(shí)后死亡的雞胚，至96小時(shí) 無(wú)論死亡與否全部收獲，置4~8°C冷卻12~24小時(shí)，收獲雞胚液，混合于無(wú)菌容器中，置 2~8°C保存。
[0020] 2.制苗用雞α干擾素蛋白的制備發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，按發(fā)酵罐容積70%配制培養(yǎng) 基，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0~7. 2,按培養(yǎng)基總體積0.02%加入消泡劑。滅菌 后按1%~2%接種量接種生產(chǎn)用菌種，按總體積0. 1%的比例加入10%的硫酸卡那霉素 注射液，36°C培養(yǎng)，2. 5小時(shí)后，每隔10分鐘取樣測(cè)0D600nm值，待菌液的0D600nm值達(dá)到 0. 6~0. 8之間時(shí)，再按總體積0. 1%的比例加入10%的硫酸卡那霉素注射液，同時(shí)加入滅 菌0. 5mol/L α -乳糖溶液，使其終濃度達(dá)到〇. 〇3mol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中 通過(guò)調(diào)節(jié)進(jìn)氣量和攪拌速度來(lái)控制溶氧35%~50%。培養(yǎng)結(jié)束后，快速冷卻發(fā)酵液至15°C 以下。菌液培養(yǎng)完成后離心收集菌體，按每克菌體濕重加 IOml生理鹽水進(jìn)行菌體重懸，超 聲波破菌，破菌時(shí)溫度控制在15°C以下。在顯微鏡下檢查破菌液，待99%以上菌體破碎后 停止破菌。破碎后的菌液離心，收集上清液，硫酸銨法提取純化雞α干擾素蛋白，經(jīng)過(guò)濾除 菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 3.滅活將病毒液置于滅活瓶?jī)?nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混 合，甲醛溶液的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)后取出，置2~8°C保存。
[0022] 4.半成品檢驗(yàn)
[0023] (1)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。
[0024] (2)病毒含量測(cè)定將病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋?zhuān)?0'10'10' 10- 8、10-95個(gè)稀釋度，分別尿囊腔接種10~11日齡SPF雞胚，每胚0. lml，同時(shí)設(shè)接種生理 鹽水對(duì)照5枚，每胚0. 2ml。置36~37°C