一種提高l-天冬酰胺酶分泌表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高L-天冬酰胺酶分泌表達的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. I. 1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對某些腫瘤的抑制作用，尤 其對急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物， 對骨髓細(xì)胞沒有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要 是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過程中通過美拉德反應(yīng)生成，在食物中加 入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。
[0003] -些微生物、哺乳動物及植物被證實含有L-天冬酰胺酶。因為動物血清中L-天 冬酰胺酶含量低，且提取工藝復(fù)雜，微生物具有易培養(yǎng)，成本低等優(yōu)點，成為學(xué)者研宄的重 點，目前研宄的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、 Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶產(chǎn)量低，近年來利用基因工程技術(shù)將 L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達，利用工程菌產(chǎn)L-天 冬酰胺酶已成為一個重要來源。
[0004] 本發(fā)明通過在大腸桿菌中共表達帶有信號肽的天冬酰胺酶及信號肽切割酶1印B， 得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首先要解決的問題是提供一種提高天冬酰胺酶分泌表達的方法，是將信號 肽融合至天冬酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號肽的天冬酰胺酶的基因與信號肽切割酶 基因在大腸桿菌中進行共表達，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述信號肽的基因如SEQ ID NO. 1?8任一所 不O
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述信號肽是pelB。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述天冬酰胺酶來源于枯草芽孢桿菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9所 不O
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述信號肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以載體pET_20b(+)表達編碼融合有信號肽的天冬 酰胺酶的基因。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以載體pRSF-duet(+)表達編碼信號肽切割酶的基 因。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將含有編碼融合有信號肽的天冬酰胺酶的基 因與載體PET-20M+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3);將信號肽酶基因1印B連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌。挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng) 12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為3%。菌體長到OD6c?為1. 5時，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培 養(yǎng)溫度降到30°C，培養(yǎng)24h。收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
[0015] 本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種胞外分泌天冬酰胺酶能力增強的重 組菌，是將信號肽融合至天冬酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號肽的天冬酰胺酶的基因 與信號肽切割酶基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行共表達得到的。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述信號肽的基因如SEQ ID NO. 1?8任一所 不O
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述信號肽是pelB，編碼pelB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述天冬酰胺酶來源于枯草芽孢桿菌。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9所 不O
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述信號肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以載體pET_20b(+)表達編碼融合有信號肽的天冬 酰胺酶的基因。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以載體pRSF-duet (+)表達編碼信號肽切割酶的基 因。
[0023] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
[0024] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將含有編碼融合有信號肽的天冬酰胺酶的基 因與載體pET-20b(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3);將信號肽酶基因1印B連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。
[0025] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述胞外分泌天冬酰胺酶能力增強的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)天 冬酰胺酶的方法，是將重組菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中， 接種量為3%;菌體長到0D_為1. 5時，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)溫度降到30°C，培養(yǎng)24h。 收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
[0026] 本發(fā)明通過在天冬酰胺酶的N端融合pelB信號肽，使重組菌的胞外天冬酰胺酶酶 活提高了 20倍，進一步共表達1印B信號肽酶，可將天冬酰胺酶酶活在此基礎(chǔ)上提高1. 45 倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【附圖說明】
[0027] 圖1融合表達不同信號肽對胞外天冬酰胺酶產(chǎn)量的影響
[0028] 圖2共表達信號肽酶對胞外天冬酰胺酶產(chǎn)量的影響
[0029] 圖3天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株蛋白電泳圖；I !Marker，2 :R20b-pelB胞外，3 : R20b-pelB/pRSF-duet-l印B 胞外，4 :R20b-pelB 胞內(nèi)，5 :R20b-pelB/pRSF-duet-l印B 胞內(nèi)。
【具體實施方式】
[0030] LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7· 0。
[0031] TB 培養(yǎng)基：蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/LKH2P04,72mmol/L K2HPO 40
[0032] 采用分光光度法測定天冬酰胺酶酶活，1個單位天冬酰胺酶酶活定義為：酶活定 義：在37°C反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酰胺釋放1 μ mol NH3所需要的酶量為一個 酶活單位（U/ml)。酶活測定條件：37°C條件下，ImllOmM K2HPO4-KH2PO4(PH7. 5)，0· lmll89mM 天冬酰胺，〇. 3ml發(fā)酵上清液，保溫30分鐘，0. lmll. 5M TCA終止反應(yīng)。利用Shimadzu UV-1240在436nm處測定吸光值，通過硫酸銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。
[0033] 實施例1天冬酰胺酶基因融合信號肽
[0034] 信號肽 pelB 的核苷酸序列：ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCGGTCTGCTGCTCCTCG CTGCCCAGCCGGCGATGGCC
[0035] 信號肽 ompA 的核苷酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGITTC GCTACCGTAGCGCAGGCCGCTCCG
[0036] 信號肽 torT 的核苷酸序列：ATGCGCGTACTGCTATTTTTACTTCTTTCCCTTTTCATGTTGCCG GCATTTTCGGCTGAT
[0037] 信號肽 TorA 的核苷酸序列：ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCACGTCGGCGTTTTCTG GCACAACTCGGCGGCTTAACCGTCGCCGGGATGCTGGGGCCGTCATTGTTAACGCCGCGACGTGCGACTGCGGCGCA AGCG
[0038] 信號肽 sufl 的核苷酸序列：ATGTCACTCAGTCGGCGTCAGTTCATTCAGGCATCGGGGATTGCA CTTTGTGCAGGCGCTGTTCCCCTGAAGGCCAGCGCAGCCGGG
[0039] 信號肽 DsbA 的核苷酸序列：ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTT AGCGCATCGGCGGCGCAG
[0040] 信號肽 Dmsa 的核苷酸序列：ATGGAACGCAGAAGITTTCTAAAAATGAGTGCAGCCATGGGCTGC GCAGCAACGGTCACTGGCTGT
[0041] 信號肽 ansZ 的核苷酸序列：ATGAAAAAACAACGAATGCTCGTACTTTTTACCGCACTATTGTTT GTTTTTACCGGA
[0042] 合成 8 種信號肽：pelB、ompA、sufl、DsbA、Dmsa、TorT、TorA、ansZ。PCR 反應(yīng)條件 為：94°C 5min，30 個循環(huán)（98°C 15s、50°C 15s、72°C 20s)，72°C 10min。以 pET-22b(+)-ansZ 作為模版，以pl、p2作為正、反向引物，通過PCR擴增出一條具有N-末端His標(biāo)簽但缺失天 然信號肽的天冬酰胺酶基因。PCR反應(yīng)條件為：94°C 5min，30個循環(huán)（98°C 15s、50°C 15s、 72°C 80s)，72°C 10min。PCR 擴增體系：模板 I yL，上下游引物各 I yL，dNTP Mix4yL， 5XprimeSTARBufferl0yL，滅菌的雙蒸水 32.5yL，primeSTAR DNA 聚合酶 0.5yL。采用 膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度。通過重疊 PCR的方 式，將信號肽與天冬酰胺酶進行融合。
[0043] Pl:TGTTCACATTCTCCTGAAACAAAAG
[0044] P2: CCGCTCGAGTCAATACTCATTGAAATAAGCTTGG (下劃線 XhoI 酶切位點）
[0(Μ5] 表1引物序列
[0046]
【主權(quán)項】
1. 一種提高天冬酰胺酶分泌表達的方法，其特征在于，將信號肽融合至天冬酰胺酶的 N端，將編碼該融合有信號肽的天冬酰胺酶的基因與信號肽切割酶基因在大腸桿菌中進行 共表達。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述信號肽的基因如SEQ ID NO. 1? 8任一所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9 所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述信號肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以載體pET-20b(+)表達編碼融合有信號 肽的天冬酰胺酶的基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以載體pRSF-duet(+)表達編碼信號肽切 割酶的基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將含有編碼融合有信號肽的天冬酰胺酶 的基因與載體口￡!'-2013(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌1? 〇%?&(0￡3);將信號肽酶基因1印8連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌；挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為3 %;菌體長到00_為1. 5時，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng) 溫度降到30°C，培養(yǎng)24h，收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
9. 一種胞外分泌天冬酰胺酶能力增強的重組菌，其特征在于，是將信號肽融合至天冬 酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號肽的天冬酰胺酶的基因與信號肽切割酶基因轉(zhuǎn)化大腸 桿菌進行共表達得到的。
10. 權(quán)利要求9所述的重組菌在天冬酰胺酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高L-天冬酰胺酶分泌表達的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過在天冬酰胺酶的N端融合pelB信號肽，使重組菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，進一步共表達lepB信號肽酶，可將天冬酰胺酶酶活在此基礎(chǔ)上提高1.45倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【IPC分類】C12N9-82, C12N1-21, C12N15-70
【公開號】CN104611317
【申請?zhí)枴緾N201510102732
【發(fā)明人】劉松, 阮潔, 馮岳, 陳堅, 堵國成, 黎清華
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年3月9日