海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ -內(nèi)酰胺酶(y-lactamses，EC 3.5.2.-)是催化酰胺類化合物酰胺鍵水解的一種新型酰胺酶。(+) γ -內(nèi)酰胺酶能夠高效率動力學(xué)拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的(_) γ -內(nèi)酰胺。光學(xué)純的(-)γ -內(nèi)酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體，是抗艾滋病藥物(_)阿巴卡韋和(-)卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料。此外，γ-內(nèi)酰胺酶催化外消旋體γ-內(nèi)酰胺還可獲得不同構(gòu)型的γ-氨基丁酸類似物(GABA)。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性(王建軍等，微生物學(xué)報(bào)，2010)。人們在發(fā)現(xiàn)(+) γ-內(nèi)酰胺酶之前，常規(guī)方法制備光學(xué)純的(-)γ-內(nèi)酰胺一般采用不對稱合成的方法，此方法的缺點(diǎn)是原料昂貴、工藝繁瑣、生產(chǎn)成本高、造成環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)(Velazquez F., Current Organic Chemistry, 2002) ο運(yùn)用γ -內(nèi)酰胺酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)(-)γ -內(nèi)酰胺，具有反應(yīng)條件溫和、工藝簡單、生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。目前對微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶的研宄處于γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌株的選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化(Taylor SJC, et al.Journal oftheChemical Society:Chemical Communicat1ns, 1990 ;李海泉等，微生物學(xué)報(bào)，2006 ;陳紅干等，中國生物工程雜志，2012等)、酶學(xué)性質(zhì)以及相關(guān)基因克隆(Wang JJ, et al.Annalsof Microb1logy, 2009 ；Qin XX,et al.Appl B1chem B1technol, 2010 ；Yang M, etal.B1technology Letters, 2012等)階段，且集中于中溫γ -內(nèi)酰胺酶。低溫γ-內(nèi)酰胺酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可減少加工工藝，縮短加工過程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)(朱非等，微生物學(xué)報(bào)，2002)，因此，低溫γ -內(nèi)酰胺酶上述特性將有助于其推廣和應(yīng)用，具有更廣闊的工業(yè)開發(fā)價(jià)值與市場應(yīng)用優(yōu)勢。低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用將對生物酶法拆分制備(-)γ -內(nèi)酰胺工業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。目前國內(nèi)外還未見海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，該方法主要是海洋微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10?16°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫γ -內(nèi)酰胺酶，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法具體包括以下步驟:
[0004](I)將能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種活化，再逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C—25°C —22°C —20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，當(dāng)菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長即馴化結(jié)束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基為:酵母膏0.2?5.0g, N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0?
10.0g，NH4C12.0 ?15.0g，Na2HPO40.1 ?1.0g，NaH2PO40.1 ?1.0g,MgSO40.05 ?0.5g，瓊脂粉20g，自來水1.0L, pH為6.0?8.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0005]所述的能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號:1.761或1.647或1.1830 ；
[0006](2)按常規(guī)方法將步驟⑴中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?16°C逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養(yǎng)基為:酵母膏 20.0 ?25.0g，蛋白胨 10.0 ?20g，NaCll0.0 ?15.0g, MgSO40.05 ?0.5g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來水 1.0L，pH 為 6.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0007](3)將液體二級種子按發(fā)酵液體積的3?9%接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?16°C培養(yǎng)72?144h時(shí)，S卩海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶結(jié)束；所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:牛肉膏10.0?25.0g，蛋白胨2.0?20.0g，乙酰胺5.0?20g，Tween800.1?
0.4g，(NH4)2SO4L O ?1.5g，KH2PO4L 4 ?2.0g, MgSO40.1 ?0.4g，CaCl20.2 ?0.3g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來水 1.0L，pH 為 5.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0008](4)將步驟(3)的發(fā)酵液在4000?8000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；
[0009](5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將步驟(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0010]進(jìn)一步的，步驟(I)中產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種的活化培養(yǎng)基為:酵母膏20.0?25.0g，蛋白胨 10.0 ?12.0g, NaCl 10.0 ?15.0g，瓊脂 20.0 ?25.0g,自來水 1.0L, pH 值為7.4，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
[0011]本發(fā)明中使用的能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，初期活化和生長條件按中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供的說明進(jìn)行。菌株先活化、再經(jīng)過逐級低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶時(shí)按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10?25vt %甘油制成的菌懸液、在-80°c條件下可以長期保藏。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0013](I)本發(fā)明生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理并不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)，尤其是在低溫下還具有高酶活力及高催化效率；改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量；
[0014](2)本發(fā)明的方法簡化了加工工藝，縮短加工時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率并從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備的環(huán)節(jié)，省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；
[0015](3)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶主要應(yīng)用于拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的㈠γ -內(nèi)酰胺，低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用可進(jìn)一步提高原料的利用率及轉(zhuǎn)化率，而且該酶制劑在應(yīng)用中操作簡單、方便、快捷、成本低，具有更廣闊的工業(yè)開發(fā)價(jià)值與市場應(yīng)用優(yōu)勢。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1
[0018](I)培養(yǎng)基制備
[0019]①菌種活化培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g, NaCll0.0g，瓊脂20.0g,自來水1.0L, pH7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0020]②菌種低溫馴化培養(yǎng)基:酵母膏0.2g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0g, NH4Cl 2.0g,Na2HP040.lg, NaH2P040.lg, MgSO40.05g，瓊脂粉 20g，自來水 1.0L, pH 值為 6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0021]③液體種子培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g, MgSO40.05g ；ZnSO4.7H202.4mg，自來水 1.0L, pH6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0022]④液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏l(xiāng)0.0g，蛋白胨2.0g,乙酰胺5.0g, Tween800.lg，(NH4)2SO4L 0g, KH2PO4L 4g，MgSO40.lg, CaCl20.2g，ZnSO4.7H20 2.4mg，自來水 1.0L, pH 值
5.0，121°C，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0023](2)將產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌種說明進(jìn)行初始活化；
[0024](3)將(2)中活化好的菌種于低溫馴化培養(yǎng)基中逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C— 25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，馴化 8 天左右，使菌種能在低溫環(huán)境中生長良好，當(dāng)菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長即馴化結(jié)束；
[0025](4)按常規(guī)方法將步驟(3)中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?12°C培養(yǎng)48?72h后，按5vt%的接種量進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；
[0026](5)將⑷中制備的二級種子按發(fā)酵液體積3?5%的接種量接入5L的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?12°C培養(yǎng)120?144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶結(jié)束；
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