一種鮑肌肉萎縮癥病毒的離子交換層析提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一種鮑病毒的提取方法，尤其是涉及一種鮑肌肉萎縮癥病毒的離子交換層析提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鮑，俗稱鮑魚，屬軟體動(dòng)物腹足綱，是貝類的一種在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。鮑魚又是中華民族的傳統(tǒng)美食，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖品種，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。病毒或噬菌體廣泛存在于鮑等各類生物體內(nèi)，它們的存在能夠調(diào)節(jié)宿主腸道種群，平衡宿主及其體內(nèi)共生微生物的代謝關(guān)系，控制病害的發(fā)生等。
[0003]近年來，在中國(guó)的養(yǎng)殖鮑魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種神秘的鮑肌肉萎縮癥病毒。它的形態(tài)和大小未知，已測(cè)序的基因組與目前已知的所有病毒基因組相似性都很低，是一種全新的病毒。該病毒在各類鮑養(yǎng)殖品種中廣泛存在，但在其它貝類生物中卻未被發(fā)現(xiàn)。尤其重要的是該病毒可能與擊垮我國(guó)雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)的鮑低溫病毒病爆發(fā)密切相關(guān)。
[0004]目前，制約該病毒研宄的技術(shù)瓶頸之一就是提取方法。而制約該病毒深入研宄和應(yīng)用的技術(shù)瓶頸之一就是提取方法?，F(xiàn)有提取方法均采用超速離心的分離，但其樣品處理能力有限，只限于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模使用，無法擴(kuò)大生產(chǎn)。同時(shí)，提取出的病毒純度不高，局限了下游的進(jìn)一步應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鮑肌肉萎縮癥病毒的離子交換層析提取方法。該方法能有效分離鮑肌肉萎縮癥病毒，成本低。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種鮑肌肉萎縮癥病毒的離子交換層析提取方法，包括以下步驟:
(1)在液氮環(huán)境下，將病毒感染鮑組織樣品磨成粉；
(2)鮑組織樣品粉末中加入SB緩沖液，然后勻漿，所得勻漿液；
(3)對(duì)勻漿液進(jìn)行離心處理，棄上清液，沉淀用15-25mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液重懸，獲得重懸液，濾膜過濾，備用；
(4)所得重懸液上離子交換柱進(jìn)行離子交換層析，以三羥甲基氨基甲烷溶液為平衡緩沖液A，三羥甲基氨基甲烷溶液和氯化鈉的混合溶液為洗脫液B進(jìn)行洗脫，收集含病毒的洗脫液，然后離心，棄上清，所得的沉淀為鮑肌肉萎縮癥病毒。
[0007]本發(fā)明所述步驟(I)中，鮑組織樣品為除性腺外的各組織。
[0008]本發(fā)明所述步驟(2)中，SB緩沖液含有以下組分:0.1-0.5M NaCl，40_60mMTris-HCl, 2-8mM CaCl2, 2-8mM MgCl2，pH7.5。所述鮑組織樣品與SB緩沖液之間的質(zhì)量體積比為 1: 9-12 (g/ml)。
[0009]所述步驟(3)中離心處理先進(jìn)行至少2次高速離心，即采用高速冷凍離心機(jī)在4°C下，以轉(zhuǎn)速11000-14000rpm對(duì)勻漿液離心15_40min，然后進(jìn)行至少I次超高速離心處理，即使用超速離心機(jī)在10°c下，以轉(zhuǎn)速20000-40000 rpm離心0.5_2h。
[0010]所述步驟(3)中濾膜的孔徑為0.22-0.45um。
[0011]所述步驟(3)中，所述三羥甲基氨基甲烷溶液的用量為9-llml，其pH值為8.0。
[0012]所述步驟(4)中，離子交換柱的層析介質(zhì)Q Sepharose Fast Flow，柱高5cm，直徑1.5cm。所述三羥甲基氨基甲烷溶液和氯化鈉的混合溶液的pH8.0，其中含20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)和IM氯化鈉(NaCl)。
[0013]所述步驟(4)，洗脫起始時(shí)，所述平衡緩沖液A與洗脫液B的比例為100%: 0，在上樣30min后開始調(diào)整緩沖液A和緩沖液B，在2h內(nèi)緩沖液A:緩沖液B的比例由100%:O調(diào)整至O: 100%，洗脫過程中，平衡緩沖液A與洗脫液B的流速為1.5-2.5ml/min。
[0014]所述步驟(4)的洗脫過程中，每5ml收集一管洗脫液，然后取各管洗脫液Iul進(jìn)行qPCR檢測(cè)，獲得各管洗脫液中的病毒拷貝數(shù)，從而確定含病毒的洗脫液。所述步驟(4)中，對(duì)含病毒的洗脫液的離心處理采用超速離心機(jī)在10°C下，以轉(zhuǎn)速20000-40000 rpm離心
0.5~2ho
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著的效果:
(I)由于超速離心方法是在超高離心力(>20，OOOg)下實(shí)現(xiàn)的一種分離方法，而且經(jīng)常需要使用氯化銫等重金屬鹽作為分離介質(zhì)，操作條件較為劇烈，容易對(duì)病毒分子造成破壞。本發(fā)明的整個(gè)操作過程相比超速離心分離方法更為溫和，也更有利于保護(hù)病毒分子的完整性。
[0016](2)超速離心分離方法最大處理樣品的能力只有幾百毫升，而層析方法處理能力可以達(dá)到幾升甚至數(shù)百升，是當(dāng)前工廠化擴(kuò)大生產(chǎn)的主要方式，更方便大規(guī)模樣品制備。
[0017](3)超速離心機(jī)屬高精尖儀器，其使用和維護(hù)成本均高于層析分離系統(tǒng)。本發(fā)明提供的離子交換層析提取方法所使用的試劑和耗材均為生化實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)材料，成本低廉；同時(shí)層析方法易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模從而進(jìn)一步降低成本。因此，本方法相比于現(xiàn)有超速離心分離方法成本大大降低。
[0018](4)現(xiàn)有的超速離心分離方法的分離純化的時(shí)間由24小時(shí)，而本發(fā)明的分離純化時(shí)間可控制在3小時(shí)內(nèi)，大大縮短了分離時(shí)間，提高效率。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中離子交換層析收集的洗脫液的qPCR檢測(cè)結(jié)果；
其中，180-200mL位置處對(duì)應(yīng)小峰即為病毒峰。
[0020]圖2是本發(fā)明提取的病毒的熒光顯微鏡圖；
圖中，光斑即為病毒顆粒。
[0021]圖3是本發(fā)明提取的病毒的電子顯微鏡圖；
圖中，可見直徑為20-30nm的球型病毒顆粒布滿整個(gè)視野。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
(一)鮑肌肉萎縮癥病毒的提取
(I)取1g病毒感染雜色鮑組織(除性腺外的各組織)，在液氮環(huán)境下研磨成粉末。
[0023](2)鮑組織樣品粉末中加入10mL SB緩沖液，充分勻漿，得勻漿液。其中，SB緩沖液的 pH 為 7.5，每 10ml 中含有 0.2M NaCl，50mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, 5mM MgCl20
[0024](3)對(duì)勻漿液使用普通高速冷凍離心機(jī)離心處理2次，條件為:4°C下，以轉(zhuǎn)速12000rpm離心30min，收集上清液。所得上清液使用超速離心機(jī)對(duì)上清液在10°C下，以轉(zhuǎn)速40000rpm離心lh，棄上清，所得的沉淀即為鮑肌肉萎縮癥病毒粗提物。沉淀用1ml緩沖液A充分懸浮，獲得重懸液，該緩沖液A為20mM Tris, pH8.0。所得重懸液用0.22um濾膜過濾。
[0025](4)所得重懸液上離子交換柱進(jìn)行離子交換層析，離子交換柱的層析介質(zhì)為QSepharose Fast Flow，柱高5cm，直徑1.5cm。以緩沖液A為平衡緩沖液，緩沖液B為洗脫液，緩沖液B含20mM Tris和IM NaCl，pH8.0。洗脫起始時(shí)，流速1.5mL/min，緩沖液A:緩沖液B的比例為100%:0，上樣30min后開始調(diào)整緩沖液A和緩沖液B，在2h內(nèi)緩沖液A:緩沖液B的比例由100%: O緩慢調(diào)整至O: 100%。在洗脫過程中，用試管收集洗脫液，每5ml 一管，直至收集完畢。分別取各管溶液lul，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)qPCR檢測(cè)結(jié)果確定病毒組分位置，病毒含量尚的洗脫液即為病毒組分。如圖1所不，180-200mL位置處對(duì)應(yīng)小峰即為病毒峰，即第36-40管的洗脫液中病毒含量高。qPCR檢測(cè)條件:20uL PCR反應(yīng)體系中包括 IuL 的模板(層析收集液)，1uL iQ SYBR Green Supermix (B1-Rad, Hercules, CA,USA)，500 nmol/L AbSV3F3 上游引物(TGCCTAAAATTCACACAAACT)，500 nmol/L AbSV3B3 下游引物(ACAGACAAAATGTTTTTCATCG)。在Eppendorf Mastercycler ep realplex (Eppendorf,Hamburg, Germany)焚光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?4。C I min, 30個(gè)循環(huán):94。C 30 S，60。C 30 s, 72。C 20 s,最后 72。C 延伸 lOmin。
[0026]合并含病毒的溶液，使用超速離心機(jī)對(duì)溶液在10°C下，以轉(zhuǎn)速40000rpm離心lh，棄上清，所得的沉淀為鮑肌肉萎縮癥病毒。熒光顯微鏡下(圖2-3)，可見病毒顆粒光斑，可見直徑為20-30nm的球型病毒顆粒布滿整個(gè)視野，說明病毒得到有效分離，且純度高。
[0027]實(shí)施例2
(I)取9g病毒感染雜色鮑組織(除性腺外的各組織)，在液氮環(huán)境下研磨成粉末。
[0028](2)鮑組織樣品粉末中加入10mL SB緩沖液，充分勻漿，得勻漿液。其中，SB緩沖液的 pH 為 7.5，每 10ml 中含有 0.15M NaCl，45mM Tris-HCl,4mM CaCl2,4mM MgCl20
[0029](3)對(duì)勻漿液使用普通高速冷凍離心機(jī)離心處理2次，條件為:4°C下，以轉(zhuǎn)速IlOOOrpm離心25min，收集上清液。所得上清液使用超速離心機(jī)對(duì)上清液在10°C下，以轉(zhuǎn)速30000rpm離心1.5h，棄上清，所得的沉淀即為鮑肌肉萎縮癥病毒粗提物。沉淀用Ilml緩沖液A充分懸浮，獲得重懸液，該緩沖液A為25mM Tris, pH8.0。所得重懸液用0.22um濾膜過濾。
[0030](4)所得重懸液上離子交換柱進(jìn)行離子交換層析，離子交換柱的層析介質(zhì)為QSepharose Fast Flow，柱高5cm，直徑1.5cm。以緩沖液A為平衡緩沖液，緩沖液B為洗脫液，緩沖液B含20mM Tris和IM NaCl，pH8.0。洗脫起始時(shí)，流速2.0 mL/min，緩沖液A:緩沖液B的比例為100%: 0，上樣30min后開始調(diào)整緩沖液A和緩沖液B，在2h內(nèi)由緩沖液A:緩沖液B的比例為100%: O緩慢調(diào)整至O: 100%。在洗脫過程中，用試管收集洗脫液，每5ml 一管，直至收集完畢。分別取各管溶液lul，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)qPCR檢測(cè)結(jié)果確定病毒組分位置，病毒含量尚的洗脫液即為病毒組分。qPCR檢測(cè)條件:20uLPCR反應(yīng)體系中包括 IuL 的模板(層析收集液)，1uL iQ SYBR Green Supermix (B