一種提高桿狀病毒殺蟲效率的遺傳改造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高桿狀病毒殺蟲效率的遺傳改造方法，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 利用病毒防治害蟲，不僅防治效果好，而且對人畜安全、對天敵安全、不污染環(huán) 境、不使害蟲產生抗藥性。此外，病毒能在環(huán)境中積累，在害蟲種群中形成流行病而長期控 制害蟲蟲口密度，具有明顯的經濟和生態(tài)效益，是目前比較理想和有發(fā)展前途的生物殺蟲 劑。
[0003] 桿狀病毒殺蟲劑以其不污染環(huán)境、不破壞生態(tài)平衡、對天敵及人畜安全、害蟲不 易產生抗性、能在田間長期控制害蟲種群等優(yōu)點，成為生物防治研宄中的熱點，在生產上 有著廣闊的應用前景。但殺蟲速度慢等缺點制約著其進一步推廣和應用?；蚬こ碳夹g 為增強桿狀病毒殺蟲效果提供了潛在的可能性。目前，提高重組桿狀病毒殺蟲毒性的研 宄主要集中于利尿激素（DH)基因、保幼激素酯（JHE)基因、蛻皮激素（MH)基因、幾丁質酶 (Chitinase)基因、增效蛋白（enhancin)基因、Bt基因、神經毒素基因、植物蛋白酶抑制劑 基因等（呂鴻聲，昆蟲病毒分子生物學，中國農業(yè)科技出版社，1998年，北京)，但多數(shù)基因提 高桿狀病毒殺蟲效果尚不理想。
[0004] 核型多角體病毒（NPV)對鱗翅目幼蟲具有很高的致病力，是昆蟲病毒種類中最具 潛力者，也是研宄應用最廣泛的一類。目前，國內外商品化生產的昆蟲病毒制劑，絕大部分 是NPV (核型多角體病毒殺蟲劑的開發(fā).左拴彥等.山西農業(yè)大學學報.1998，，1(4): 302-305)。家蠶核型多角體病毒（BmNPV)屬于甲型桿狀病毒屬，是桿狀病毒的一種，也是宿 主域較寬的桿狀病毒之一，可感染多種農林害蟲。為使桿狀病毒成為理想的生物殺蟲劑，利 用生物技術對野生型病毒進行改造是目前提高桿狀病毒殺蟲效果的最有效最優(yōu)前景的途 徑。
[0005] 豆天蛾核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus ;Shan_Ying Zhu, Jian-Ping Yi, Wei-De Shen, Li-Qun Wang, Hua-Gang He, Yong Wang, Bing Li and Wen-Bing Wang. Genomic sequence, organization and characteristics of a new nucleopolyhedrovirus isolated from Clanis bilineata larva, BMC Genomics，2009， 10 :91)的基因（在GenBank中的登錄號為DQ504428)全長3111個堿基，其推導 的蛋白質序列全長1036個氨基酸，在N端和C端分別具有一個信號肽（SP)和跨膜結構域 (TM)，并在內部存在一個金屬蛋白酶特征序列，即與鋅離子結合相關的HEXXH模序。對已完 成全基因組測序的桿狀病毒進行檢索，發(fā)現(xiàn)Clbil38同源物在所有II類α -桿狀病毒中保 守存在，此外還見于桑燈蛾昆蟲痘病毒（AmEPV)等。但是，Clbil38及其同源物的功能尚不 明確。
[0006] 本發(fā)明提供一種利用豆天蛾核型多角體病毒因提高桿狀病毒家蠶 核型多角體病毒（BmNPV)殺蟲效率的方法，家蠶核型多角體病毒（BmNPV)基因組中沒有 Clbil38同源物，因此將Clbil38基因導入BmNPV，以研宄Clbil38的功能，并通過實驗首次 證實C7M2J6基因提高桿狀病毒殺蟲效率，并通過定點突變研宄證實HEXXH模序對Clbi 138 蛋白生物學功能的重要性，從而證實因編碼了一種金屬蛋白酶。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于公開一種利用豆天蛾核型多角體病毒C7M2J6基因提高桿狀 病毒殺蟲效率的遺傳改造方法。
[0008] 本發(fā)明所述的來自豆天蛾核型多角體病毒（ClbiNPV)的基因（GenBank登 錄號為DQ504428, SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示)，來自豆天蛾核型 多角體病毒，該基因的開放閱讀框（ORF)全長為3111個堿基，編碼1036個氨基酸，含HEXXH 模序，針對HEXXH模序的基因定點突變研宄證實，J盛因具有金屬蛋白酶活性。
[0009] Clbil38及其同源物在II類α桿狀病毒中廣泛存在，但其功能尚不明確，由于 Clbil38及其同源物都具有與金屬蛋白酶相關的保守的HEXXH模序，易推測它們也具有相 似的功能；Clbil38及其同源物中其他序列也易被取代，從而產生仍具有生物學活性的突 變體。
[0010] 本發(fā)明采用以下技術方案以達到上述目的： 本發(fā)明提供一種利用豆天蛾核型多角體病毒因提高桿狀病毒殺蟲效率的 方法，該方法主要包括以下步驟： (1) 以pEGFP-Nl載體為模板，利用PCR技術擴增EGFP基因，經KpnI和XhoI雙酶切后 連入供體質粒pFastBacDUAL，形成重組質粒pDUAL-EGFP ; (2) 根據(jù)基因的開放閱讀框設計并合成一對引物P3 (SEQ ID Ν0·5)、Ρ4 (SEQ ID NO. 6)，下劃線部分為BamHI和KpnI酶切位點；根據(jù)Clbil38基因再設計1條引物Ρ5 (SEQ ID NO. 7)，下劃線部分為HindIII的酶切位點。
[0011] (3)以豆天蛾核型多角體病毒（ClbiNPV)基因組DNA作為模板，以P3/P5為引物進 行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段，經BamHI和HindIII雙酶切后，連入經 同樣雙酶切重組質粒pDUAL-EGFP，形成重組供體質粒pDUAL-EGFP-Clbi 138。
[0012] (4)分別取 pDUAL-EGFP、pDUAL-EGFP-Clbil38 轉化含有 BmNPV 的大腸桿菌 DHlOB 菌株，涂布于LB平板培養(yǎng)基，靜止培養(yǎng)使藍斑顯色充分，挑取白色菌落，進一步在LB平板培 養(yǎng)基上劃線純化；將純化的白色菌落接種于含卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素的LB液體培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng) 18~20h，提取重組 BmNPV DNA (vBmEGFP、vBmEGFP/Glbi138)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 該方法將來自豆天蛾核型多角體病毒（ClbiNPV)的基因 （SEQ ID NO. 1)導入 家蠶核型多角體病毒（BmNPV)后，重組BmNPV的殺蟲效率顯著增強，半致死濃度（LC5tl)為 12. 51 pfu，比對照組減少11倍，半數(shù)致死時間（LT5tl)為84. 12 h，比對照組縮短42. 9%，且 病蟲體內液化更嚴重。因此，Clbil38基因及其編碼的蛋白質在害蟲的防治領域具有重要 應用價值。
[0014] 本發(fā)明中所述Clbil38是一種金屬蛋白酶，能參與病蟲體內組織的降解。將 Clbil38基因導入家蠶核型多角體病毒（BmNPV)能顯著降低重組病毒的半致死濃度，縮短 害蟲的半致死時間，并加速病蟲體內組織降解，從而達到提高蟲害的防治效果，具有明顯的 經濟和生態(tài)效益，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0015] 圖 I 盛因的 RT-PCR 結果。M :DL2000 DNA marker ;1~8 為 Clbil38 基因 的 RT-PCR 產物，ClbiNPV 感染幼蟲的時間依次為 0h，4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h ;9~16 為 Clbipoh 基因的 RT-PCR 產物，感染時間依次為 Oh，4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h。
[0016] 圖2 :Clbil38 HEXXH模序的定點突變。圖為通過基因定點突變技術創(chuàng)造的突變位 點的測序鑒定。
[0017] 圖3 :桿狀病毒病毒感染死亡的家蠶。A :vBmEGFP/Glbi138感染家蠶(死亡后24h); B :vBmEGFP感染家蠶(死亡后24h，對照組)。
[0018] 圖 4 :Clbil38 HEXXH 模序突變的病毒學效應。1-4 :依次為 vBmEGFP、vBm EGFP/Glbil38M1、 vBm EGFP/Glbil38M2和 vBm EGFP/Glbil38M3感染 3 天的家蠶（無死亡個體)，5 :vBm EGFP/Glbi138感染 3 天剛 死亡的家蠶。
[0019] 圖5 :Clbil38及其同源物多序列比對(局部)。陰影所示為保守序列，雙下劃線所 示為高度保守的HEXXH模序，是金屬蛋白酶的活性中心。
【具體實施方式】
[0020] 基因的表達模式分析 根據(jù)ClbiNPV基因組Clbi 138基因（在GenBank中的登錄號為DQ504428)序列設計并 合成一對引物 Pl (SEQ ID N0.3)、P2 (SEQ ID N0.4)。
[0021] 采用Trizol試劑提取ClbiNPV感染的雀紋天蛾(野外收集蟲卵后人工飼養(yǎng)）中腸 的RNA，進行RT-PCR分析，所采用的PCR反應條件為：94°C 4min; 94°C 20s，56°C 30s，72 °C lmin，30個循環(huán)；72°C 5miruClbil38基因在病毒感染宿主12h時即有少量轉錄，轉錄 時間比ClbiNPV基因組中多角體（Clbipoh)基因早12h，隨著感染時間的延長，67心7激基 因的轉錄逐漸增強(見圖1)。
[0022] 2. Clbil38蛋白的亞細胞定位分析 以pEGFP-Nl載體(購自TAKARA公司）為模板，利用PCR技術擴增EGFP (增強型綠色熒 光蛋白）基因，經KpnI和HindIII雙酶切后連入供體質粒pFastBacl (購自Invitrogen公 司），形成重組質粒pFB-EGFP。
[0023] 根據(jù)基因的開放閱讀框（ORF)設計并合成一對引物P3 (SEQ ID NO. 5)、 P4 (SEQ ID NO. 6)。下劃線部分為BamHI和KpnI酶切位點。
[0024] 以ClbiNPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：94°C 4min ; 94°C 20s，50°C 30s，72 °C 3min，32 個循環(huán)；72°C 5min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠 回收目的片段，經BamHI和KpnI雙酶