玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERF1基因啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米是我國(guó)主要的糧食作物之一，在保障國(guó)家糧食安全中起著重要作用。目前我國(guó)面臨人口不斷增加和耕地資源不斷減少的雙重壓力，提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)能有效的緩解糧食安全問(wèn)題。生物與非生物脅迫，尤其是干旱、鹽漬和高溫等環(huán)境脅迫，嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)，每年全球作物因非生物脅迫造成的產(chǎn)量損失比生物脅迫多30%。因此，非生物脅迫是造成作物產(chǎn)量減少的主要限制因素，嚴(yán)重制約著當(dāng)前農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中遇到干旱、冷害、熱激、鹽堿等逆境時(shí)，植物為了更好的生長(zhǎng)及適應(yīng)不良環(huán)境，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套特有的防御機(jī)制。因此，克隆挖掘玉米抗逆相關(guān)基因及其啟動(dòng)子對(duì)研宄抗逆分子遺傳機(jī)理和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0003]ERF基因受激素或環(huán)境因素的誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物對(duì)各種逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，提高其耐鹽性和抗旱性以及對(duì)冷害和滲透脅迫的抗性。因此，克隆玉米抗逆相關(guān)的ERF基因啟動(dòng)子，有助于研宄玉米對(duì)非生物脅迫抗性分子機(jī)理，同時(shí)對(duì)提高玉米對(duì)非生物脅迫的耐受力有重要指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，該基因啟動(dòng)子能夠直接驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，在非生物脅迫下如鹽處理和滲透處理能夠使外源基因快速高效的表達(dá)，可以提高植株對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抗性能力。
[0005]本發(fā)明提供一種新的玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子，詳見(jiàn)序列表，其啟動(dòng)子核苷酸全長(zhǎng)序列為2217 bp ;同時(shí)提供了該基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，即在鹽脅迫、滲透脅迫條件下，ZmERFl基因啟動(dòng)子序列啟動(dòng)目的基因在根部、葉、花序等部位進(jìn)行表達(dá)，提高了玉米植株對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抗性能力。
[0006]本發(fā)明利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子導(dǎo)入到玉米植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向操作，獲得目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，這不僅可以實(shí)現(xiàn)目的基因在鹽脅迫、滲透脅迫條件等逆境情況下進(jìn)行表達(dá)，而且為玉米非生物逆境脅迫的應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。
【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1和圖2分別是本發(fā)明玉米自交系N04 ZmERFim因的表達(dá)方式圖；
圖3是本發(fā)明玉米葉片的⑶S染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0008]以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述:
玉米自交系N04為本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室培育產(chǎn)品，選自爆裂玉米品種BL03，培育地點(diǎn)中國(guó)河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。
[0009]克隆載體pMD18-T、DNA marker購(gòu)自北京全式金公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自百泰克公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒購(gòu)于上海生工；引物合成以及測(cè)序均在北京華大公司進(jìn)行。
[0010]B1-Red PCR擴(kuò)增儀、Eppendorf臺(tái)式高速恒溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、低溫冰箱、電泳儀、超凈工作臺(tái)、瓊脂糖電泳凝膠成像系統(tǒng)、高壓滅菌鍋、移液槍。
[0011]實(shí)施例1
結(jié)合圖1和圖2鹽脅迫、滲透脅迫條件下玉米自交系MMZmERFl基因的表達(dá)及ZmERFl基因啟動(dòng)子的克隆:
a.玉米自交系N04DNA的提取
取約0.5 g幼嫩葉片置于研缽中，加入液氮后研磨成粉末，將粉末迅速裝入2.0 mL的離心管中，加入800 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% SLS提取液，加入800 μ L按照比例為25:24: I的苯酸、氯仿與異戊醇組成的混合液，充分混勾，65°C溫育30min，冷卻至室溫后，12000 rpm離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的1.5 mL離心管中，加入0.6倍上清液體積的預(yù)冷異丙醇混勾，12000 rpm離心10 min,棄上清液，用75%乙醇漂洗，漂洗后短暫離心，留DNA于管底進(jìn)行干燥，DNA干燥后用滅菌水溶解，置于_20°C冷藏備用；其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% SLS提取液是將 100 mmol.L-1 Tris-HClUOO mmol.L-1 NaCl、20 mmol.L-1 EDTA 和 10 g.L-1 SLS 混勻，然后調(diào)節(jié)PH=8.0后得到的混合液；
b.ZmERFl基因啟動(dòng)子的克隆
根據(jù)玉米自交系N04 ZmERFl基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)基因特異性引物，這兩對(duì)引物擴(kuò)增的片段相重疊，基因特異性引物序列I為:F1391:5' GCGGATCCATTTAAGCTTGAAGTTGATGGC3’ 和 R1391:5’TATTACCCCCATGGACATAGCT3’ ；基因特異性引物序列 II:F865:5’AAGCTATGTCCATGGGGGTAAT3’ 和 R865 5’GCAGATCTATGTAGTCGAAGATGATTGCGC3’ ；以玉米自交系N04的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為:5 μ L Hifi Buffer (10Χ)，2 μ L 2.5mol.L-1 dNTP，I μ L Primer-F (R), I μ L Taq DNA Polymerase, I μ L 模板DNA，ddH20補(bǔ)足50 yL ； PCR擴(kuò)增體系程序?yàn)?95°C預(yù)變性4 min，95°C變性45 sec，60°C退火45 sec，72°C延伸60 sec，共循環(huán)34次；72°C延伸10 min, 10°C forever，擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用回收試劑盒回收，并且連接到PMD18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的啟動(dòng)子序列分別為PMD18-1391和PMD18-865，具體序列詳見(jiàn)序列表人工序列I和序列表人工序列2 ；
c.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
用BamHI和NcoI雙酶切連接在T載體上的1391 bp啟動(dòng)子序列，同時(shí)用BamHI和NcoI雙酶切PCAMBIA1301載體，回收后將pCAMBIA1301載體與1391 bp啟動(dòng)子序列連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取單克隆搖菌PCR檢測(cè)正確的單克隆提質(zhì)粒，酶切鑒定；鑒定正確攜帶有1391 bp啟動(dòng)子序列的pCAMBIA1301載體再用NcoI和BglII雙酶切，同時(shí)用NcoI和BglII雙酶切連接在T載體上的865 bp啟動(dòng)子序列，回收后將攜帶有1391 bp啟動(dòng)子序列的pCAMBIA1301載體與865 bp啟動(dòng)子序列連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取單克隆搖菌PCR檢測(cè)正確的單克隆提質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得ZmERFl基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列2217 bp ;將構(gòu)建好的pCAMBIAl301-ZmERFl promoter_GUS載體用BamHI和BglII雙酶切鑒定，鑒定正確后利用凍融法將pCAMBIAl301-ZmERFl promoter-GUS載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，準(zhǔn)備侵染擬南芥；
d.玉米自交系N04ZmERFl基因啟動(dòng)子序列分析
將克隆得到的ZmERFl基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順勢(shì)元件的預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)分析顯示該啟動(dòng)子具有植物啟動(dòng)子的典型特征，含有乙烯響應(yīng)相關(guān)元件2個(gè);ABA激素應(yīng)答ABRE元件I個(gè)；脫水相關(guān)MYBlAT元件4個(gè)、MYCATERD元件I個(gè)和MYCATRD元件I個(gè)；低溫抗寒調(diào)控元件18個(gè)、CBFHV元件8個(gè)；傷害調(diào)控WBOXNTERF元件9個(gè)；熱休克CCAATB0X元件I個(gè)；組織特異性表達(dá)調(diào)控CAATB0X元件27個(gè)；種子發(fā)育相關(guān)EB0XBNNAPA元件18個(gè)；淀粉酶相關(guān)AMYB0X2元件I個(gè)、CGACG0SAMY元件I個(gè)；糖相關(guān)WB0XHVIS0元件5個(gè)；調(diào)控根毛發(fā)育相關(guān)RHERPATEXPA 元件 2 個(gè)；
e.ZmERFl啟動(dòng)子擬南芥植株的獲得
挑取生長(zhǎng)在YEP (Rif和Kan)的含有pCAMBIA1301_ZmERFl promoter-GUS載體的單克隆菌株，接種于液體的YEP (Rif和Kan)中，28°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按照1:50接種于新的YEP中擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0.8~1，離心收集菌體，用1/2 MS加入5%的蔗糖和SilweetL-77，用農(nóng)桿菌蘸花法對(duì)擬南芥進(jìn)行侵染，收獲的TO代種子播種在含有50 mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)基上能夠生根發(fā)芽的為抗性植株，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后確定含有ZmERFl啟動(dòng)子的陽(yáng)性植株；
f.ZmERFl啟動(dòng)子活性檢測(cè)
將含有ZmERFl啟動(dòng)子的擬南芥植株灌溉10% PEG和150 mM NaCl進(jìn)行處理，分別對(duì)正常生長(zhǎng)和逆境處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行⑶S組織化學(xué)染色，詳見(jiàn)附圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株也能出現(xiàn)⑶S藍(lán)色，但是在逆境下藍(lán)色更加明顯，表明該啟動(dòng)子是一個(gè)滲透和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0012]實(shí)施例2
將ZmERFl啟動(dòng)子克隆連接到轉(zhuǎn)化載體上，然后在其下游連接一個(gè)Tnos終止子，使兩者構(gòu)建成一個(gè)轉(zhuǎn)化載體；然后將需要轉(zhuǎn)化的目的基因以正確的方向克隆連接到ZmERFl啟動(dòng)子與Tnos終止子之間，構(gòu)建好目的基因的轉(zhuǎn)化載體；接著利用基因槍轟擊法或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)組織培養(yǎng)、壓力篩選和植株再生等技術(shù)方法獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；在鹽脅迫、滲透脅迫條件下，ZmERFl啟動(dòng)子可以提高下游目的基因高效的表達(dá)。
[0013]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.玉米非生物脅迫響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子序列，其特征在于:響應(yīng)因子ZmERFl基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列2217bp:ATTTAAGCTT GAAGTTGATG GCATCAATCT GCCAGTCTGA TTTTCAGACC TATCCAACCTGACAGCCTGA CTTTAGGCAT GATTATCTCT AAATTTTTCA CAAGAACATG GCTTGCACTCTTAAGCAAAT TTGTTATCCA TTGATTGCTC TACAATTTTG ATGTGGTGAC TTAGGGCAAAAACCCTATGC TTTACAAGTT ACAAAGCCCT AAAGTGGAGC CTTTAACACT GAATTTCAGACTTAGTGTAG AACTCAAATG AGGTCCATTT TGCATTTAAG TCCAAAACTT AGGGTTTGGCTTTCAAGTCC ACATATTTGT GAACCAAAGG ACTTAAAATA CTTATTTGGC TTGGTTTTTGCACTTTAGTC CAAAAGTGGA CCAATTTTGC ATATAAACCC CTAGGGTTTG GTTTCAGGGTTTTCCAGGGT TTTAATTAGG GTTTCTGGTA TCCCAGGGGT ACAAAAGTGA TTCAAGTTTATTCTTAGGGT CATTTTATGA CTTTTACCCT AAAGCTTTTA GATTTTCTCA ACTTGGGTTAAGTTTTACCC CTTTAACCAC TATTTAGGGT TAAGTCCTTT AACCAGGGTT CTTTTTGCAAAACAACACAA CTTGTTTGAA ATTTTTGCCT AGTGAATGCA CTCTAGGTGT GTCAAACATATGCAATGCCA ATGCTATGAT GCCATGCTCA AGTTTTAGTT ACAGTAACAC CAGGGGTGTTACAATTGCTG TGGATGACGC TCAAATCCAT TGGGTCGTCT AGGCTTGAGT TGATCCAATCCTGCGTCGAT CCACTTCGCT AGACGTTCCT CCCCAGGCCC ACAAAGGGAT GACCTTGCGAAATATTGGGC CCAAAGCCTT TCGCGAGGTC TTCTAACCTT CCAGTGGACC TGGGGGATATCTGTCCCCCA CACATTATGC CCGAAGGGAG ATAATGCTTC GAAGGACAAA GGTCTTTAACACTTAAGAAT TTTGTTGCGT TGTTTCATGA TTAAGTAATA AAAACAAGAG ATCAACACTATGCTCTTTTC TTAATCGATC ATTCTAAAAA GTACATGATT TTTGTCGACT TTACACCCACTCAAAATTGG TGTAAGCACA TGCCATACAA GAGGTTCATA GAAACGATTA TCATGGCCTTAAAGAAATAT AAGATTGTCT ACAGCATGAA ACGTTCTAGA TGGGTGGTGG ATATTTTTAAATTGGAAAAT AAAATTCAGA CTGATGCTTC AATTGACATA AAATGATATT TTCTCCGTGCCACCTTCTCA GCAATTTAAT TTTTTCTATG ATTTCCATTA CATATAACAT AGTTGGCAAAACATTATTAT GAAGGATTAA CACCAGCTAC CTCGTTCTAC AAGCTATGTC CATG