AaALDH1基因啟動(dòng)子及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，設(shè)及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用，尤其設(shè)及一種在植物分泌 型腺毛中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子(proAaAL的Π )及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬的一年生草本植物，從青葛中可W提取一 種倍半祗內(nèi)醋類過(guò)氧化物一一青葛素，青葛素對(duì)治療追疾效果顯著，被世界衛(wèi)生組織稱做 是"世界上唯一有效的追疾治療藥物"。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療追疾的方 法就是青葛素聯(lián)合療法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)。植物青葛是 目前世界上唯一獲取青葛素的天然資源，但其青葛素合成量極低，僅為干重的0.1-0.8%， 使得運(yùn)種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。
[0003] 在目前的青葛基因工程研究中，多采用組成型的啟動(dòng)子，例如煙草花葉病毒35S啟 動(dòng)子(CaMV35)。運(yùn)種啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在所有的組織和器官中表達(dá)，可能會(huì)對(duì)植物 的正常生長(zhǎng)造成一定的負(fù)擔(dān)和危害。由于腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于植物的腺毛系統(tǒng)進(jìn)行 遺傳操作，不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害，可W克服組成型啟動(dòng)子的種種弊端，因此，克 隆得到青葛分泌型腺毛特異性的啟動(dòng)子對(duì)青葛素代謝工程具有較為重要的意義。
[0004] AaALDHI (青葛醒還原酶基因）編碼青葛素合成途徑下游的一個(gè)關(guān)鍵酶，可W催化 青葛素前體青葛醒和二氨青葛醒的氧化反應(yīng)。AaALDHI在葉片發(fā)育初期及不同組織部位中 的表達(dá)譜與青葛素合成途徑中分泌型腺毛特異性表達(dá)的基因 ADS、CYP71AV1和DBR2均具有 較高的相似性。因此，該基因的啟動(dòng)子也極有可能在分泌型腺毛中特異性表達(dá)。
[000引因此，本發(fā)明致力于開(kāi)發(fā)一種植物腺毛組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子，尤其是一種 AaALDHI啟動(dòng)子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種使基因在植 物分泌型腺毛中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，尤其是使AaALDHI基因在植物分泌型腺毛中特異高 效表達(dá)的啟動(dòng)子，從而為研究AaALDHI基因的表達(dá)調(diào)控和分析啟動(dòng)子上的順式作用元件奠 定基礎(chǔ)，也對(duì)利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種具有重要意義。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是能調(diào)控基因在 分泌型腺毛中特異表達(dá)，其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示。該啟動(dòng)子為特異型啟動(dòng)子。
[0008] 進(jìn)一步地，該啟動(dòng)子是青葛AaAL的Π 基因上游的啟動(dòng)子。
[0009] 進(jìn)一步地，該啟動(dòng)子上的順式作用元件包括：TATA box、CAAT box、GARE-motif、 AE-b ο X、GA-mo t i f、ARE、H沈和 TCCC-motif。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供上述啟動(dòng)子的應(yīng)用，是在利用植物分泌型腺毛組織表達(dá)和 生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步地，其中代謝產(chǎn)物為青葛素。
[0012] 本發(fā)明的又一方面提供一種載體，該載體連接有如上所述的啟動(dòng)子。該載體可W 是 pCAMBIA1391z 載體。
[0013] 本發(fā)明的再一方面，提供一種制備高產(chǎn)青葛素的轉(zhuǎn)基因青葛的方法，包括W下步 驟：
[0014] 步驟一、根據(jù)青葛基因組中AaALDHl基因啟動(dòng)子序列，利用巢式PCR克隆如上所述 的啟動(dòng)子的序列；
[0015] 步驟二、將步驟一中獲得的AaALD化基因的啟動(dòng)子的序列連入PCAMBIA1391Z載體， 獲得 pCAMB IA1391 Z-proAaALDHl 載體；
[0016 ] 步驟立、將步驟二中獲得的pCAMBIAl 391 Z-proAaAL畑1載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；
[0017] 步驟四、將步驟Ξ中獲得的帶有pCAMBIA1391Z-proAaAL的Π 載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn) 化青葛，并進(jìn)行檢測(cè)；
[0018] 步驟五、確定所述啟動(dòng)子所引導(dǎo)的GUS報(bào)告基因在植株中的表達(dá)部位。
[0019] 優(yōu)選地，其中啟動(dòng)子與青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因融合，從而加強(qiáng)青葛合成 途徑，最終提高青葛素的合成。該青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因可W是AaALD化基因等。
[0020] 優(yōu)選地，其中巢式PCR的引物序列為：
[0021 ]第一輪PCR:proALDHl-FPl: 5 '-TGGCTTGCTGTTCAAAGAAGGCTAA-3 ' ；
[0022] proALDHl-RPl: 5 '-GCCTTMCGGCCAAATCAATGTCTT-3 ' ；
[0023] 第二輪口(：1':口'〇40)化斗口2:5'-17666(：了41'170：1'1'(：174666(：1^6(：-3'；
[0024] proALDHl-RP2:5 '-GTTGCTAACACTTCTTCTGTCGCTGGAT-3 '；
[00巧]優(yōu)選地，為構(gòu)建pCAMBIA1391z-proAaALDHl載體，在proAaALDHl兩端分別引入了 HindllI的酶切位點(diǎn)和Bam HI的酶切位點(diǎn)，使用的引物序?yàn)椋?br>[0026] 1391Z-proAaALDHl-FP:5 '-CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3 '
[0027] 1391Z-proAaALDHl-RP:5'-CGCGGATCCCTTTGTTTTTTATGA-3'。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括如前所述的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，該表達(dá)盒 為proAaALDHl-GUS表達(dá)盒，在該表達(dá)盒中，可W插入青葛素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，也可 W插入想要在分泌型腺毛中表達(dá)的基因。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用有效的青葛表皮毛組織特異 性啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，可W通過(guò)分子生物學(xué)的方法構(gòu)建在青葛分泌型腺毛特異表達(dá) 目的基因的融合基因，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)入其他植物的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)目的基 因的定向操作W獲得轉(zhuǎn)基因植物，并且不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害，能廣泛用于利用 植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。另外，克隆proAaALDHl啟動(dòng)子將為 研究AaALD化基因的表達(dá)調(diào)控和分析啟動(dòng)子上的順式作用元件奠定基礎(chǔ)。
[0030] W下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體步驟及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，W 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因青葛植株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖。其中，M:分 子量標(biāo)記；泳道1:陽(yáng)性對(duì)照；泳道2:陰性對(duì)照；泳道3和4、5和6、7和8、9和10 W及11和12:分 別是5株轉(zhuǎn)基因青葛植株基因組為模版，進(jìn)行的兩次單獨(dú)的PCR得到的產(chǎn)物。
[0032] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例利用AaALDHl基因啟動(dòng)子與GUS基因融合的載體 pCAMBIA1391z-proAaALD化轉(zhuǎn)化青葛后，所獲得的轉(zhuǎn)基因青葛中的GUS組織染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人的《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(化wYork:ColdSp;ring化;rbo;rLaborato;ryPress，1989年 版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0034] 本實(shí)施例設(shè)及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國(guó)生物工程雜志，2008，28(3): 38-43》文 獻(xiàn)中公開(kāi)。根癌農(nóng)桿菌EHA105和質(zhì)粒PCAMBIA1391Z可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如可 W從澳大利亞GAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl。
[003引實(shí)施例1 AaALD化基因啟動(dòng)子的獲得
[0036] 1、培養(yǎng)青葛無(wú)菌苗
[0037] 青葛種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡Imin，再用20%(w/v)的化αο浸泡20min 后，無(wú)菌水沖洗3次-4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上，25 °C、1化/她（日光/黑夜)光照培養(yǎng)，14天后即可獲得青葛無(wú)菌苗。
[003引 2、基因組DNA的提取
[0039] 在1.5血離屯、管中放一片青葛葉片（1cm2左右大小，用冰盒盛?。尤?粒鋼珠。加 入300μΙ TPS buffer(通風(fēng)楓內(nèi)操作，TPS中含有琉基乙醇），55-60Hz，震蕩90s。再加入300μ L TPS buffer(通風(fēng)楓）d65°C水浴化(每隔20min搖一搖），可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，最長(zhǎng)1.化。冷卻 至室溫，4°C 1000化pm離屯、15min。取30化心40化L上清液。加入30化心40化L異丙醇（異丙醇 在-20°C預(yù)冷）?；旌虾笤?20°C冰箱中放置10-15min(可延長(zhǎng)至化）。取出4°C離屯、12000rpm， 吸去上清，在通風(fēng)楓中倒置l〇-15min。加入75%乙醇500-60化L，將沉淀吹打起或用手指彈 起，放在搖床上搖15-20min，重復(fù)一次。吸干液體，放在37°C中烘干，直到沉淀變?yōu)橥该?。?入50yLdd出0回溶，即獲得基因組DNA，4°C保存。
[0040] 3、PCR 擴(kuò)增
[00川 W上述獲得的基因組DM為模板，利用PCR方法擴(kuò)增AaALDHl基因啟動(dòng)子 proAaALDHl序列。為了提高產(chǎn)物的特異性，采用兩輪巢式PCR擴(kuò)增，根據(jù)基因組測(cè)序得到的 AaALDHl基因的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物如表1所示，第一輪PCR反應(yīng)體系如表2所示。 PCR條件為:95°C預(yù)變性5min;