一種klf7基因啟動(dòng)子及其活性和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種KLF7基因啟動(dòng)子及其活性和應(yīng)用，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。本發(fā)明驗(yàn)證了雞KLF7基因啟動(dòng)子在DF1細(xì)胞中具有啟動(dòng)基因表達(dá)的能力，研究了2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)該啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用，為KLF7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及KLF7在雞遺傳育種中的應(yīng)用帶來了一種新的研究工具，為篩選新的肉雞低脂基因用于優(yōu)質(zhì)低脂肉雞育種提供參考，能夠直接用于檢測復(fù)雜的KLF7轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
【專利說明】
一種KLF7基因啟動(dòng)子及其活性和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種KLF7基因啟動(dòng)子及其活性和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Krilppel-like factor 7(KLF7)，又叫ubiquitous Kruppel-like factor(UKLF)， 是一個(gè)羧基端具有3個(gè)Cys2_His2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于轉(zhuǎn)錄因子sp-KLFs家族。NCBI Gene數(shù)據(jù)庫信息檢索顯示，KLF7基因存在于青蛙、雞、小鼠和人在內(nèi)的一百多種動(dòng)物體內(nèi)。 表達(dá)分析顯示，KLF7廣泛表達(dá)于成人、哺乳動(dòng)物和鳥類的多種組織。哺乳動(dòng)物功能研究表 明，KLF7調(diào)控干細(xì)胞的分化潛能、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并且是人類肥胖及2型糖尿病和血液 疾病發(fā)生的重要調(diào)控因子。
[0003] 肉雞是人類飼養(yǎng)最普遍的家禽，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過育種工作者90多年的 不懈努力，目前，商品代肉仔雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了很高的水平。但是，由于在 長期育種過程中對(duì)生長性狀過度選擇，導(dǎo)致現(xiàn)在的商品代肉仔雞出現(xiàn)了腹部脂肪蓄積過多 的問題。腹部脂肪過多蓄積不僅影響肉雞生產(chǎn)效率，造成飼料浪費(fèi)，而且會(huì)引發(fā)肉雞猝死和 污染環(huán)境。培育優(yōu)質(zhì)低脂肉雞是控制肉雞腹部脂肪過多蓄積的有效手段。
[0004] 多個(gè)肉雞群體的研究顯示，雞KLF7編碼區(qū)（Coding DNA Sequence,CDS)的一個(gè)同 義突變的基因多態(tài)性(SNP: c. A141G; AFK10495.1: p. Pro47Pro)與肉雞腹部脂肪含量和血漿 中極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL)水平顯著相關(guān)，并且該位點(diǎn)可 能通過密碼子偏好性作用于KLF7的蛋白表達(dá)水平。高、低脂系肉雞KLF7組織表達(dá)譜分析顯 示，KLF7在7周齡高、低脂肉雞的肝，十二指腸，空腸，回腸，胸肌，腿肌，腹部脂肪，心臟，脾， 腎，胰腺，腺胃，大腦和睪丸中均有表達(dá)。分析1-12周齡肉雞腹部脂肪組織中KLF7的表達(dá)水 平發(fā)現(xiàn)，低脂系肉雞腹部脂肪組織KLF7的mRNA表達(dá)水平顯著高于高脂系肉雞腹部脂肪組織 KLF7的mRNA表達(dá)水平。這些研究表明，KLF7是肉雞腹部脂肪生長發(fā)育的重要調(diào)控基因，研究 KLF7基因在肉雞腹部脂肪組織生長發(fā)育過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有助于進(jìn)一步揭示肉雞腹 部脂肪蓄積的分子機(jī)制，并加速將KLF7應(yīng)用于低脂肉雞育種的進(jìn)程。啟動(dòng)子是目的基因的 開關(guān)，控制基因的表達(dá)，因此研究一個(gè)基因啟動(dòng)子的影響和調(diào)控因素，是明白這個(gè)基因作用 機(jī)制及調(diào)節(jié)因素的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，因此對(duì)于一個(gè)基因研究其啟動(dòng)子的區(qū)間及特性就顯得尤 為重要。
[0005] 功能研究顯示，KLF7在雞前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中均有表達(dá)，并且KLF7mRNA 表達(dá)水平隨脂肪細(xì)胞的分化呈現(xiàn)出先下降后上升再降低的趨勢;過表達(dá)KLF7促進(jìn)雞前脂肪 細(xì)胞增殖，抑制雞前脂肪細(xì)胞分化。雞KLF7很可能通過直接抑制C/ΕΒΡα基因的表達(dá)發(fā)揮對(duì) 雞脂肪細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。雖然KLF7在腹部脂肪沉積中的作用已經(jīng)被證實(shí)。但是，目 前KLF7表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，對(duì)雞KLF7基因的啟動(dòng)子的研究未見報(bào)道。確定雞KLF7啟 動(dòng)子，對(duì)于基因功能研究和低脂肉雞育種都具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種KLF7基因啟動(dòng)子及其活性和應(yīng)用，能夠直接用于檢測 復(fù)雜的KLF7轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[0007] 本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)實(shí)現(xiàn)：一種KLF7基因啟動(dòng)子，序列如序列表SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：
[0009] 1、如上所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，在DF1細(xì)胞表現(xiàn)出的啟動(dòng)子活性。
[0010] 2、如上所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄因子Gata2和Gata3對(duì)啟動(dòng)子活性的抑制 作用。
[0011] 3、如上所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，在雞的遺傳育種中的應(yīng)用。
[0012] 4、如上所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，在DF1細(xì)胞表現(xiàn)出的啟動(dòng)子活性，以重組載體 pGL3-Basic-KLF7p轉(zhuǎn)染DFl細(xì)胞，重組載體序列如序列表SEQIDNo.2所示。
[0013] 5、一種合成KLF7基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，上游引物KLF7pF:序列如序列表SEQ ID No.3所不；下游引物KLF7pR:序列如序列表SEQ ID No.4所不。
[0014] 本發(fā)明運(yùn)用在基因功能領(lǐng)域，能夠用于篩選調(diào)控KLF7表達(dá)的藥物和揭示KLF7表達(dá) 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制;運(yùn)用在肉雞生產(chǎn)領(lǐng)域，能在細(xì)胞分子水平用于篩選優(yōu)質(zhì)低脂肉雞，以及用 于優(yōu)化優(yōu)質(zhì)肉雞的飼養(yǎng)管理方案。同時(shí)本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)錄因子Gata2和Gata3對(duì)KLF7基因啟 動(dòng)子活性的調(diào)控作用，為本發(fā)明應(yīng)用于基因功能領(lǐng)域、以及篩選新的肉雞低脂基因用于優(yōu) 質(zhì)低脂肉雞育種提供參考。
【附圖說明】
[0015] 圖1為重組質(zhì)粒pGL3-Basic-KLF7p的雙酶切鑒定。
[0016] 圖2為pGL3-Basic-KLF7p啟動(dòng)子活性檢測結(jié)果。
[0017] 圖3為KLF7基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果。
[0018] 圖4為pCMV-Myc_Gata2和pCMV-Myc_Gata3表達(dá)融合蛋白鑒定結(jié)果。
[0019] 圖5為Gata2和Gata3對(duì)KLF7基因啟動(dòng)子活性影響的鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下列實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021] 下列實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] KLF7基因啟動(dòng)子的制備 [0024] 1、雞基因組DNA提取
[0025] (1)取正常培養(yǎng)的7周齡AA肉雞，翅靜脈采血lmL，將收集的雞血裝到預(yù)先加入了 10L抗凝劑(如0.5mol/L Na2EDTA)的1.5mLEP管中，上下顛倒混勻。
[0026] (2)取20yL的抗凝雞血于一個(gè)新的 1.5mLEP管中，WA445yLlXSET(100mMTris-HC1 PH7.5，100m M EDTA，高壓滅菌后，加1%的SDS)，10yL PK(10mg/mL)和25yLSDS(10%)， 充分混勻，55°C，消化12h。
[0027] (3)加500yL Tris飽和酸，充分混勾，放于搖床中上下顛倒lOmin。
[0028] (4)12000r/m 離心 lOmin，吸上清至新 EP 管。
[0029] (5)加400yL酚氯仿異戊醇（體積比24 : 23 :1)，充分混勻，放于搖床中上下顛倒 10min〇
[0030] (6) 12000r/m離心 1 Omin，吸上層至新EP管。
[0031] (7)加400yL氯仿:異戊醇(體積比23:1)，充分混勻，放于搖床中上下顛倒lOmin。
[0032] (8) 12000r/m離心 1 Omin，吸上層至新EP管。
[0033] (9)加800yL(2倍體積)無水乙醇(_20°C預(yù)冷），震蕩，可見白色絮狀沉淀。
[0034] (10)8000r/m離心10min，棄液體，留底部白色沉淀。
[0035] (11)加 lmL 70%乙醇(_20°C預(yù)冷），震蕩，洗滌白色沉淀DNA。
[0036] (12) 8000r/m離心10min，棄液體，留底部白色沉淀;將EP管倒放于濾紙上，至管壁 無液珠。
[0037] (13)加200yL 無菌 TE，55°C水浴溶解。
[0038] 2、PCR擴(kuò)增KLF7基因啟動(dòng)子
[0039] 通過UCSC基因組數(shù)據(jù)庫獲取KLF7基因組序列，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測的3種KLF7轉(zhuǎn) 錄本信息，在預(yù)測3種KLF7轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近區(qū)域設(shè)計(jì)引物KLF7pF和KLF7pR，利用該 引物克隆KLF7預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp左右序列（相對(duì)于序列XM_004942644.2第一個(gè) 喊基，-2026/+171)。
[0040]引物序列如下所示：
[0041 ] KLF7pF:5，-CGGGGTACCCGAATAAACCTAAGCATGAGCAATC-3 '
[0042] KLF7pR:5 '-GGAAGATCTCAACCAATGATAGATCCAGCGTCC-3 '
[0043]以1中提取的雞基因組DNA為模板，KLF7pF和KLF7pR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將混合物 在94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，65°C退火25s，72°C延伸2min 30s，共36個(gè)循環(huán)；72°C終延 伸1 Omin，4 °C終止反應(yīng)。
[0044] 混合液體系如下： 50ng/pL 雞基因組DNA 1 μL ΙΟμΜ引物 KLF7pF 0.2 μΙ. 10pA^|*KLF7pR 0.2 μL
[0045] 2 x擴(kuò)增緩沖液 5 μL 2.5 mM dNTP Mixture 0.8 .uL 5 U；VL LA-Taq (Takara) 0.1 μL ddH20 2.7 μΙ.
[0046] PCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇8,65°(：退火258,72°(：延伸21^11 30s，共36個(gè)循環(huán);72 °C終延伸1 Omin，4 °C終止反應(yīng)。
[0047] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。將目的基因連接在pMD-18T載體 (Takara)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5a，Amp+抗性篩選培養(yǎng)單克隆，將單克隆接種于LB液 體培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-18T-KLF7p。
[0048] 3、KLF7啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建
[0049] 分別以pMD-18T-KLF7p載體和pGL3-Basic載體為酶切底物，利用ΚρηΙ和Bgl Π 進(jìn)行 雙酶切，酶切體系如下所示： 10 X T Buffer 2 μΙ. Κρη I 1 μL
[0050] 5g/Il 1 μ!> pMD-18T- K L F7ρ i：j(pG L.3 - Basi c 2 μ§.
[0051 ] 酶切條件為:37°C酶切l(wèi)h。
[0052] 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用AXYGEN凝膠回收純化試劑盒純化回收。 利用T4DNA連接酶，連接目的基因片段KLF7p和骨架載體片段pGL3-Basic，構(gòu)建pGL3-Basic-KLF7p載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5a，Amp+抗性篩選培養(yǎng)，挑取單克隆，將單克隆接種于 LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用ΚρηΙ和Bgin進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示。將 獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pGL3-Bas i C-KLF7p。
[0053] 實(shí)施例2
[0054] KLF7基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析
[0055] 1、KLF7基因啟動(dòng)子活性驗(yàn)證
[0056]將生長狀態(tài)良好的DF1細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為5 X104個(gè)/孔， 培養(yǎng)24h后，按照Fugene HD(promega)轉(zhuǎn)染試劑說明書將pGL3-Basic-KLF7p轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞 中，每孔轉(zhuǎn)染lyg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pGL3-Basic-KLF7p為處理組，轉(zhuǎn)染3個(gè)孔，轉(zhuǎn)染pGL3-Basic (empty vector，EV)為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染3個(gè)孔，轉(zhuǎn)染pRL-TK(Promega)為內(nèi)參，每孔轉(zhuǎn)染0 · 02yg， 轉(zhuǎn)染48h之后收細(xì)胞，按照Promega公司的D ual -G丨ο ??. Luc i f eras e As say Sy s t em說明書進(jìn)行 熒光活性測定。結(jié)果如圖2所示，表明構(gòu)建的PGL3-Basic-KLF7p具有啟動(dòng)子活性。
[0057] 2、調(diào)控KLF7基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測
[0058]利用TransFac數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的KLF7基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，結(jié)果如圖 3所示，表明該序列中具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如Gata2、Gata3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 [0059] 3、轉(zhuǎn)錄因子Gata2和Gata3載體表達(dá)蛋白驗(yàn)證
[0060]將生長狀態(tài)良好的DF1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為105個(gè)/孔，培養(yǎng) 24h后，按照Fugene HD(promega)說明書分別將實(shí)驗(yàn)室保存的真核表達(dá)載體pCMV-Myc-Gata2和pCMV-Myc-Gata3轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中，每孔轉(zhuǎn)染2. Oyg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h之后收細(xì)胞。利用 western blotting技術(shù)驗(yàn)證兩個(gè)真核表達(dá)載體能否表達(dá)融合蛋白。結(jié)果如圖4所示，表明 pCMV-Myc_Gata2和pCMV-Myc_Gata3可以在DF1細(xì)胞系中成功表達(dá)雞Gata2和Gata3融合蛋 白。
[0061 ] 4、轉(zhuǎn)錄因子Gata2和Gata3對(duì)KLF7基因啟動(dòng)子活性影響的鑒定
[0062]將生長狀態(tài)良好的DF1細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為5 X104個(gè)/孔， 24h之后，按照Fugene HD(promega)說明書將各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中，每組重復(fù)三孔，分 組如下所示：
[0064]轉(zhuǎn)染48h后收細(xì)胞，按照Promega公司的Dua:l-(}lo?Luciferase Assay System說明 書進(jìn)行熒光活性測定，結(jié)果如圖5所示，表明過表達(dá)Gata2和Gata3抑制KLF7的啟動(dòng)子活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種KLF7基因啟動(dòng)子，其特征在于，序列如序列表SEQ ID No.l所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，其特征在于，在DF1細(xì)胞表現(xiàn)出的啟動(dòng) 子活性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，其特征在于，轉(zhuǎn)錄因子Gata2和Gata3對(duì) 啟動(dòng)子活性的抑制作用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，其特征在于，在雞的遺傳育種中的應(yīng) 用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KLF7基因啟動(dòng)子，其特征在于，在DF1細(xì)胞表現(xiàn)出的啟動(dòng) 子活性，以重組載體pGL3-Basic-KLF7p轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，重組載體序列如序列表SEQ ID No.2 所示。6. -種合成KLF7基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，其特征在于，上游引物KLF7pF:序列如序列表 SEQIDNo.3所示;下游引物KLF7pR:序列如序列表SEQIDNo.4所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105969768SQ201610306116
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】張志威, 陳月嬋, 馬廣偉, 云杰, 富翠雯, 付國德
【申請(qǐng)人】石河子大學(xué)