一種調(diào)控豬aebp1的啟動子及構(gòu)建方法、轉(zhuǎn)染載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控豬AEBP1的啟動子及啟動子的構(gòu)建方法，含有啟動子的轉(zhuǎn)染 載體及轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 高等生物基因的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的精細(xì)調(diào)控，因而具有嚴(yán)格的時(shí)間及空間 有序性?；虻谋磉_(dá)調(diào)控由多階段調(diào)控水平共同完成，它是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，主要包 括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后五個(gè)水平，其中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控最為關(guān)鍵。啟動子是轉(zhuǎn) 錄水平上的重要調(diào)控元件，它位于DNA結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)，通過與轉(zhuǎn)錄因子互作來調(diào)控 基因的表達(dá)（武力，1999)。因此，通過對啟動子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等方面的研究，有助 于更好地了解基因如何發(fā)揮其功能。
[0003] aP2是脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志基因，它的啟動子區(qū)域存在脂肪細(xì)胞分化過程中已知 的兩個(gè)重要因子C/EBPa和PPARy的結(jié)合位點(diǎn)，為上調(diào)表達(dá)。近年來，在aP2基因啟動子鄰 近增強(qiáng)子區(qū)域AE-1發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子-脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（AEBP1)。
[0004] AEBP1是一種轉(zhuǎn)錄抑制物，兼具蛋白酶和DNA結(jié)合活性（Heetal.，1995)，是調(diào)節(jié) 性B樣（regulatoryB_1ike)駿肽酶家族的一員（MuiseandRo, 1999)，因此，AEBP1 具有 羧肽酶（carboxypeptidase，CP)活性，在脂肪生成中表達(dá)下調(diào)。AEBP1中CP區(qū)突變后造成 CP活性缺失，使得AEBP1失去抑制轉(zhuǎn)錄活性，反之若AEBP1具有CP活性就能夠抑制轉(zhuǎn)錄，因 此AEBP1的CP活性對于其行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能極其重要（Heetal.，1995)。關(guān)于AEBP1調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制功能的具體機(jī)制尚不清楚，可能是通過剪切一般性轉(zhuǎn)錄因子而實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)， 利用酵母雙雜交系統(tǒng)，顯示AEBP1與G蛋白異源三聚體丫5亞基有蛋白互作。AEBP1的轉(zhuǎn) 錄抑制功能由Gy5調(diào)節(jié)，而Gy5的抑制活性由脂肪生成刺激調(diào)節(jié)，因此，AEBP1在脂肪生 成過程中可以作為信號因子Gy5的效應(yīng)器（Parketal.，1999)。此外，研究還表明AEBP1 能調(diào)節(jié)絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)的活性。
[0005] AEBP1在脂肪細(xì)胞分化過程中具有非常重要的生物學(xué)作用。在小鼠3T3-L1細(xì)胞系 中，AEBP1的表達(dá)量在細(xì)胞分化初期最高，隨著分化時(shí)期的增加逐漸降低，在分化末期未見 表達(dá)（Heetal.，1995)。AEBP1在人體的表達(dá)與之相似，研究顯示，在人的初代培養(yǎng)造骨細(xì) 胞中能分離到AEBP1基因cDNA，但最后的硬化期則關(guān)閉表達(dá)（Ohnoetal.，1996)。
[0006] AEBP1有兩種不同的轉(zhuǎn)錄本，分別編碼2種不同的蛋白質(zhì)，即AEBP1和主動脈羧肽 酶類樣蛋白（Aorticcarboxypeptidase-likeprotein，ACLP)，而ACLP是AEBP1 的非核內(nèi) 同形異構(gòu)體，該蛋白的N端與AEBP1相比多了 380個(gè)氨基酸。兩種同形異構(gòu)體分別由AEBP1 基因通過選擇性剪切機(jī)制產(chǎn)生的兩種mRNA所編碼，其功能也完全不同（Roetal.，2001)。 原位雜交顯示ACLP在主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而骨骼肌細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，在血管平滑肌細(xì) 胞分化中表達(dá)上調(diào)（Layneetal.，1998)，而AEBP1在脂肪細(xì)胞分化中則表達(dá)下調(diào)（Heet al.，1995;Kimetal.，2001)。AEBP1在腦中表達(dá)最高，次之的是白色脂肪組織，腎和心臟， 在棕色脂肪組織、骨骼肌、小腸、肺、脾及睪丸均有表達(dá)（R〇etal.，2001)。Western雜交顯 示ACLP主要分布于成年鼠主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)，而動脈外膜、心、肝、骨骼肌或腎中則不表 達(dá)（Layneetal.，1998)。因此，對AEBP1基因，尤其是對AEBP1啟動子的研究具有重要意 義。截止目前，尚見到研究豬AEBP1基因啟動子功能的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種調(diào)控豬AEBP1的啟動子及啟動子的構(gòu)建 方法，含有啟動子的轉(zhuǎn)染載體及轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，該啟動子活性較強(qiáng)，具備獨(dú)立 的啟動功能。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種調(diào)控豬AEBP1的啟動 子，所述啟動子為SEQIDN0. 10、SEQIDN0. 11或SEQIDN0. 12所示的核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種調(diào)控豬AEBP1的啟動子的構(gòu)建方法，包 括以下步驟：
[0010] (1)以GenBank登錄號：CU928907的核苷酸序列為模板，設(shè)計(jì)正反向引物F/R，PCR 擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增片段第一外顯子ATG上游2000bp序列作為啟動子候選片段；
[0011] ⑵以啟動子候選片段為模板，設(shè)計(jì)3個(gè)缺失片段P1、P2、P3的正反向引物P1F/R、 P2F/R、P3F/R，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為調(diào)控豬AEBP1的啟動子。
[0012] 所述正反向引物F/R為：
[0013]正向引物F:5' -GTGGCTGCCTGTTCATCATCG-3'
[0014]反向引物R:5' -CTTTGCGGACTGGAAGTGTG-3'。
[0015] 所述正反向引物P1F/R為：
[0016] 正向引物PIF:5 ' -CTAGCTAGCCGAGAAGCCTTATGGAAACA-3 '
[0017]反向引物P1R:5' -CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3'。
[0018] 所述正反向引物P2F/R為：
[0019]正向引物P2F:5' -CTAGCTAGCTGGCTTCGTCTGAGGCTAT-3'
[0020] 反向引物P2R:5' -CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3 '。
[0021] 所述正反向引物P3F/R為：
[0022] 正向引物P3F: 5 ' -CTAGCTAGCTCCACGCCCGGCTCCTCCTC-3 '
[0023]反向引物P3R:5' -CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3 '。
[0024] 步驟⑴中PCR反應(yīng)體系為：模板DNA50ng、10XBuffer2. 5yL、dNTPs濃度 為200ymol/L、每條引物濃度為0.4ymol/L、lUTaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積 25μ1 ；
[0025] ?0?反應(yīng)條件為：94°(：預(yù)變性41^11;94°(：變性5〇8,60°(：退火5〇8,72°(：延伸11^11， 共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin;
[0026] 步驟⑵中PCR反應(yīng)體系為：模板DNA50ng、10XBuffer2. 5yL、dNTPs濃度 為200ymol/L、每條引物濃度為0.4ymol/L、lUTaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積 25μ1 ；
[0027]PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min;94°C變性5〇8,58或60°(：退火5〇8,72°(：延伸 lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0028] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種含調(diào)控豬AEBP1的啟動子的轉(zhuǎn)染載體， 所述轉(zhuǎn)染的載體為pGL3_basic。
[0029] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種含調(diào)控豬AEBP1的啟動子的轉(zhuǎn)染載體 的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0030] (1)將豬AEBP1啟動子的缺失片段與pMD-18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，涂布在LB平板上培養(yǎng)，挑選陽性單克隆進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn) 行質(zhì)粒抽提，命名為重組質(zhì)粒TA-Q，進(jìn)彳丁NheI和HindIII雙酶切；
[0031] (2)對載體pGL3_basic進(jìn)行NheI和HindIII雙酶切；
[0032](3)將步驟⑴和步驟⑵的酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布 在Amp+/LB平板上培養(yǎng)，挑選陽性單克隆進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果正確的陽性克隆擴(kuò)大培 養(yǎng)，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提，命名為缺失載體pGL3-basic-Q。
[0033]步驟（1)和（2)中雙酶切的反應(yīng)體系為：10XBuffer2. 5-5μL、NheI0· 5-1μL、 HindIII0· 5-1μL、質(zhì)粒載體5μL，加ddH20至25μL;反應(yīng)條件為：37°C反應(yīng)2h。
[0034]步驟（3)中連接的反應(yīng)體系為：10XT4DNALigaseBuffer1yL、T4DNALigase 1μL、pGL3-basic酶切產(chǎn)物0. 5μL、豬AEBP1基因啟動子缺失片段7. 5μL，總體積10μL; 反應(yīng)條件為：16°C連接12h。
[0035] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種調(diào)控豬AEBP1的啟動子在調(diào)控豬AEBP1 表達(dá)中的應(yīng)用。
[0036] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種調(diào)控豬AEBP1的啟動子在豬遺傳改良 中的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明有益效果
[0038](1)本發(fā)明首次對豬AEBP1的啟動子進(jìn)行研究，通過缺失該基因啟動子的不同片 段，得到3種具有較強(qiáng)活性的新的啟動子。本發(fā)明的新的啟動子能夠調(diào)控豬AEBP1基因的 表達(dá)，為豬遺傳改良提供了新的工具和選擇。
[0039] (2)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明構(gòu)建的3個(gè)缺失載體pGL3-basic-Ql、 pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3 在豬腎臟細(xì)胞PK-15 中均有較強(qiáng)活性，其中pGL3-basic-Q1 的活性最高。本發(fā)明的結(jié)果最終獲得1483bp的啟動子片段（_337bp到-1819bp)，即本發(fā)明 構(gòu)建的重組表達(dá)載體pGL3-basic-Ql中包含的啟動子片段，具備獨(dú)立的啟動功能。
【附圖說明】
[0040] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0041] 圖1為大白豬DNA電泳檢測結(jié)果，圖中，
[0042] 1泳道為大白豬DNA，2泳道為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量。
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