一種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法，包括以下步驟：提取山核桃葉片中的DNA；引物的設(shè)計(jì)及合成，接頭處理；酶切；將接頭與酶切片段連接；PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收；回收產(chǎn)物與PMD18-T載體的連接；序列測定及分析。本發(fā)明具有節(jié)約成本、簡便易行的的特點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。
【專利說明】—種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]山核桃(Carya cathayensis Sarg.)為胡桃科山核桃屬，山核桃油味清香,營養(yǎng)豐富，是優(yōu)良的食用油，是我國特有的名優(yōu)干果和木本油料植物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。山核桃主要分布于浙、皖兩省交界的天目山區(qū)周圍，地處北緯29° -31°，東經(jīng)118° -120°，包括浙江臨安、淳安、安吉、建國和安徽寧國、歙縣、旌得、績溪等縣市。山核桃是浙西北山區(qū)農(nóng)民脫貧致富，走向富裕的重要經(jīng)濟(jì)支柱，是一種重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹種。
[0003]但山核桃存在營養(yǎng)生長時(shí)間長，且樹體高大，不易采摘，良種化和園藝化推廣困難，形成了山核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)巨大的瓶頸。植物嫁接作為植物無性繁殖中的一項(xiàng)重要園藝技術(shù)，是解決山核桃良種化和園藝化栽培的重要手段。黃堅(jiān)欽等(2001)對山核桃嫁接成活進(jìn)行了解剖學(xué)觀察，確定了山核桃嫁接經(jīng)過了愈傷組織形成、對接、維管束橋的形成及維管分化等過程。鄭炳松等(2002)對山核桃嫁接成活的生理生化特性進(jìn)行了分析，研究表明砧、穗含水量、蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量等生理生化因子變化對山核桃嫁接成活有顯著的影響嫁接作為植物無性繁殖中的一項(xiàng)重要園藝技術(shù)，是解決山核桃良種化和園藝化栽培的重要手段。
[0004]作為主要內(nèi)在蛋白(membrane intrinsic protein, MIP)大家族的成員之一,水通道蛋白有利于水分和其它小分子物質(zhì)如過氧化氫等的跨膜運(yùn)輸，參與了植物水分的長距離運(yùn)輸、細(xì)胞滲透平衡的調(diào)控以及氣孔的關(guān)閉，器官的運(yùn)動(dòng)，種子萌發(fā)等生長發(fā)育過程。根據(jù)AQP的定位及序列同源性和結(jié)構(gòu)特征，目前通常將植物AQPs分為五類:位于質(zhì)膜上的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs),又可分為 PIP1、2 二個(gè)亞類；位于液泡膜上的液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs),又分為α、β、Y、δ和ε-TIP五個(gè)亞類；存在于共生根瘤類菌體周圍膜上的類Nod26膜內(nèi)在蛋白(nodulin26_like intrinsic proteins,NIPs);小分子喊性膜內(nèi)在蛋白(small and basicintrinsic proteins, SIPs),分為 SIPl 和 SIP2 二個(gè)亞類;類GlpF (glycerol facilitator)膜內(nèi)在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins,GIPs)。球蒴蘚基因組中除具有PIPs、TIPs、NIPs、SIPs 和 GIPs 五類 AQP 外，還具有 HIP (hybrid intrinsic proteins)和 XIPs (Xintrinsic proteins)兩個(gè)新類別。
[0005]水是植物細(xì)胞的重要組成成分，植物水通道蛋白是細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)水分快速運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，作為植物水通道蛋白的一個(gè)亞類，質(zhì)膜內(nèi)在蛋白分為PIPl和PIP2兩個(gè)亞類PIPs定位于原生質(zhì)膜上，所有的PIPs均高度保守，與植物種類無關(guān)?？椎廓M窄，為典型的高水分選擇性通道蛋白。在所有已知的高等植物PIPs中，存在兩個(gè)高度保守的區(qū)域:GGGANXXXXGY和 TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN，分別位于 C 環(huán)和 E 環(huán)，可能與 PIPs 功能的特異性有關(guān)。PIPs分為PIPl和PIP2兩個(gè)亞類，兩者的區(qū)別在N-端和C-端的不同。PIPl比PIP2具較長的N-端和較短的C-端，而且在序列當(dāng)中各有相應(yīng)的保守氨基酸。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中采用常規(guī)PCR技術(shù):是基于全序列已知的基因。具體見:李?yuàn)檴?，遲彥，李凌飛，等.啟動(dòng)子克隆方法研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2005，25 (7):9-16?，F(xiàn)有技術(shù)中采用PCR技術(shù):是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR，從而獲得完整的啟動(dòng)子的方法。存在以下缺陷:1)PCR過程中容易產(chǎn)生DNA環(huán)化，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，造成擴(kuò)增效率差，經(jīng)常得不到滿意的結(jié)果；2)酶切片段太長也會使擴(kuò)增效率下降，試驗(yàn)成本高；3)工作量大，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種節(jié)約成本、簡便易行的克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法。其技術(shù)方案如下:
[0008]一種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法，包括以下步驟:
[0009]A、DNA 提取
[0010]B、引物設(shè)計(jì)及合成
[0011]根據(jù)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的eDNA全長，利用Primerf.0設(shè)計(jì)啟動(dòng)子下游的特異性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成:
[0012]特異性引物WK-1:AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAG
[0013]WK-2: TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACA
[0014]WK-3: CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC
[0015]通用引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司引物合成，
[0016]通用引物adapter-long:GTM TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCCGGGC TGGT
[0017]adapter-short:ACCAGCCC
[0018]API:GTAATACGACTCACTATAGGGC
[0019]AP2:ACTATAGGGCACGCGTGGT ；
[0020]C.接頭處理
[0021]由英濰捷基合成的接頭adapter-long和adapter-short分別稀釋成100 μ mol/L,混合，95°C變性5分鐘，慢慢冷卻至室溫，_20°C保存；
[0022]D.酶切
[0023]使用Dra1、Stu I,Eco V和Pvu II酶切基因組DNA，電泳檢測，最后用24:1的氯仿:異戊醇抽提后回收，反應(yīng)體系為:5μ I的ioong/μ I基因組DNA，ly I的內(nèi)切酶，2μ I的10Χ buffer，加 ddH20 至總體積為 20 μ I ；
[0024]Ε.將接頭與酶切片段連接
[0025]10 μ I 的酶切 DNA，2y I 的 50 μ M接頭，2 μ I 的 10Χ buffer, I μ I 的 T4DNA連接酶，加ddH20至總體積為20 μ 1，16°C連接過夜；
[0026]F.PCR 擴(kuò)增
[0027]以APl和WKl為引物進(jìn)行第一輪PCR，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板以AP2和WK3為引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增:
[0028]Fl在0.2ml離 心管中配制下列反應(yīng)液:[0029]1.0 μ I 的連接產(chǎn)物，2.0 μ I 的 10 XEx Taq Buffer =Mg2+Plus, 1.6 μ I 的 dNTPMixture 各 2.5mM,0.4μ I 的引物 1:10μΜ，0.4μ I 的引物 2:10μΜ，0.2μ I 的 TaKaRa ExTaq:5U/ μ L, up to20 μ I 的 ddH20 ；
[0030]F2充分混勻，短暫離心:
[0031]設(shè)定PCR 儀，反應(yīng)條件如下:94°C，3min -MV 30sec，72 V 3min,循環(huán) 10 次；94°C 30sec,67°C 3min，循環(huán) 25 次；72°C 10min，4°C保存；
[0032]G.特異片段回收
[0033]步驟如下:
[0034]Gl通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術(shù)刀片將目的片段DNA瓊脂糖凝膠切下，放入1.5ml離心管中；
[0035]G2根據(jù)膠塊的重量和濃度，加400 μ I的Buffer B2 ；
[0036]G3將離心管置于50°C水浴5-10min，間混勻，直至完全溶化；
[0037]G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2體積1/3的異丙醇，混勻；
[0038]G5將融化好的溶液吸入吸附柱，8000g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；
[0039]G6向吸附柱加入500 μ I Wash solution, 9000g離心30sec,倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；
[0040]G7重復(fù)步驟G6 —次；
[0041]G8將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，9000g離心Imin ；
[0042]G9 往吸附膜中央加入 20 μ I Elution buffer,室溫靜置 l_2min, 9000g 離心 lmin,將所得到的DNA溶液放入_20°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)；
[0043]H.回收產(chǎn)物與PMD18-T載體的連接
[0044]在PCR管中，用T-Vector與特異性片段進(jìn)行連接，操作步驟如下:
[0045]Hl 加載體 PMD18-T1 μ I ；
[0046]Η2 加目的 DNA 片段 1-4 μ I ;
[0047]Η3 加 Solution I 緩沖液 5 μ I ；
[0048]Η4 加水至 10 μ I ;
[0049]Η5在16°C下連接8小時(shí)以上；
[0050]1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0051]Il感受態(tài)細(xì)胞冰上溶化5分鐘,加入待轉(zhuǎn)化的連接液或者質(zhì)粒,冰上靜置30min后;
[0052]I242°C水浴熱擊60s，冰上冷卻l_2min ；
[0053]13 加入 800 μ ILB 培養(yǎng)基，200rpm、37°C振蕩培養(yǎng) Ih ；
[0054]14取100 μ I涂板，37°C倒置培養(yǎng)14_16h后挑取單菌落搖菌；
[0055]15 菌液 PCR ;
[0056]J.序列測定及分析
[0057]將通過鑒定后，明確已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的離心管中，送上海生工測序；
[0058]測定的序列用DNAMAN，BLAST軟件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列進(jìn)行比較分析。
[0059]進(jìn)一步優(yōu)選，步驟A中DNA提取的步驟為:
[0060]Al稱取0.5g新鮮嫩芽，在液氮中迅速研磨，至白色粉末狀；
[0061]A2將粉末轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加入3ml65°C預(yù)熱的pH8.0的CTAB提取液，包括:2% CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA,0.1M Tris-HCl 和 2% PVP，30 μ L β -琉基乙醇，搖勻后65°C溫浴40min，不時(shí)搖動(dòng)；
[0062]A3加入3ml的24:1的氯仿:異戍醇混合液，混勻后，室溫12000rpm離心10 min ；
[0063]A4取上清液于IOml離心管中，重復(fù)步驟A3兩次；
[0064]A5取上清液于2ml離心管中，加入2ml預(yù)冷的異丙醇，緩慢充分混勻，_20°C靜置Ih ；
[0065]A6用玻璃鉤撈出沉淀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入70%的乙醇漂洗2_3次；
[0066]A7棄乙醇，風(fēng)干DNA沉淀，用600 μ I TE緩沖液或ddH20溶解，加入3 μ 110mg/mlRNase，混勻，37°C溫浴30min ;_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0067]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:A1步驟中采用的DNA提取方法為改良的CTAB 法中所用的 CTAB 的主要成分是:2% CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl 和2% PVP(pH8.0)，濃度 較高的NaCL更加有利于去除組織材料中的多糖(多糖與RNA結(jié)合較緊密，不易去除)，EDTA的存在，減少DNA的降解。本實(shí)驗(yàn)得到DNA后，再用TE: 5mo1.T1NaC1、5% SOSA.0mo1.L-1Tris-HCU0.6mol.T1EDTA, ρΗ8.0 溶解，用 RNase 降解 RNA，這樣就更加的保證了 DNA的純度，大大的減少了 DNA中所含有的雜質(zhì)，有效的去除了 DNA中的RNA，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，免除了污染，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，與PCR技術(shù)相比較而言，該技術(shù)成本低，工作量小，避免了 DNA環(huán)化，改進(jìn)的接頭可以通過形成鍋柄結(jié)構(gòu)有效抑制非特異性序列的擴(kuò)增，由于利用接頭的PCR法不需要DNA環(huán)化，通常適用于尋找已知cDNA周圍未知啟動(dòng)子或其它調(diào)控區(qū)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1是第一次步移產(chǎn)物；
[0069]圖2是第二次步移產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0070]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0071]本發(fā)明所得的山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列如SEQ ID:1所示。
[0072]測序后分析表明，獲得山核桃CcPIPl基因啟動(dòng)子序列876bp。采用PlantCARE和PLACE等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)及調(diào)控元件分析的結(jié)果表明，該序列具有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件:2個(gè)CAAT box，位于-601，-348，是啟動(dòng)子和增強(qiáng)子去的順式調(diào)控元件，應(yīng)答ABA和干旱反應(yīng)；7 個(gè) TATAbox，位于-135，-418，-435，-493，-507，-850，-864，是啟動(dòng)子中心元件；1個(gè)G-box，位于-783，應(yīng)答厭氧、光、激發(fā)子、ABA和MeJA處理，I個(gè)MYC (CANNTG)元件和I個(gè)MYB (WAACCA)元件位于-659，它們都是干旱和ABA應(yīng)答順式調(diào)控元件；還找到了組織特異性元件，2個(gè)GATA元件，位于-437，-668 ;1個(gè)應(yīng)答脯氨酸和低滲透反應(yīng)的元件PRE (ACTCAT)位于-149 ； I個(gè)應(yīng)答糖和激素信號的元件TATCCA element (TATCCA)，位于-31，I個(gè)位于-78水楊酸傷害和糖信號的W-BOX元件，6個(gè)D0FC0REZM元件(AAAG)，位于-41，-201，-295，-465，-475，-482 ;5個(gè)GT-1保守序列(GRWAAW)，是光應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件，位于—337，-437，-472，-479，-866 ；I 個(gè) G-box,位于-783，I 個(gè) Box III，位于-560,是蛋白結(jié)合位點(diǎn)；1個(gè)位于-116的脫落酸應(yīng)答順式調(diào)控元件ABRE。此外還有多個(gè)光應(yīng)答相關(guān)兀件，如:G_box, GA-motif, GTlnotif, MNFl 等。
[0073]以上所述，僅為本發(fā)明最佳實(shí)施方式，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)?！?br> 【權(quán)利要求】
1.一種克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法，其特征在于，包括以下步驟: A.DNA提取 B.引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的cDNA全長，利用Primerf.0設(shè)計(jì)啟動(dòng)子下游的特異性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成: 特異性引物 WK-1:AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAG WK-2: TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACA WK-3: CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC 通用引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司引物合成， 通用引物adapter-long:GTAA TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCC GGGCTGGT
adapter-short:ACCAGCCC
API:GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2:ACTATAGGGCACGCGTGGT ； C.接頭處理 由英濰捷基合成的接頭adapter-long和adapter-short分別稀釋成100 μ mol/L,混合，95°C變性5分鐘，慢慢冷卻至室溫，-20°C保存； D.酶切 使用Dral、Stu 1、Eco V和P`vu II酶切基因組DNA，電泳檢測，最后用24:1的氯仿:異戊醇抽提后回收，反應(yīng)體系為:5μ I的lOOng/μ I基因組DNA，ly I的內(nèi)切酶，2μ I的IOXbuffer,加 ddH20 至總體積為 20 μ I ； Ε.將接頭與酶切片段連接 10 μ I 的酶切 DNA，2 μ I 的 50 μ M 接頭，2 μ I 的 lOXbuffer，I μ I 的 T4DNA 連接酶，加ddH20至總體積為20 μ 1，16 °C連接過夜； F.PCR擴(kuò)增 以APl和WKl為引物進(jìn)行第一輪PCR，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板以AP2和WK3為引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增: Fl在0.2ml離心管中配制下列反應(yīng)液:
1.0μ I 的連接產(chǎn)物，2.0 μ I 的 IOXEx Taq Buffer =Mg2+Plus, 1.6μ I 的 dNTP Mixture各 2.5mM,0.4μ I 的引物 1:10μΜ，0.4μ I 的引物 2:10μΜ，0.2μ I 的 TaKaRa Ex Taq:5U/μ L, up to20 μ I 的 ddH20 ； F2充分混勻，短暫離心: 設(shè)定PCR儀，反應(yīng)條件如下:94 0C, 3min ；94 V 30sec，72 V 3min,循環(huán)10次；94°C 30sec,67°C 3min，循環(huán) 25 次；72°C 10min，4°C保存； G.特異片段回收 步驟如下: Gl通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術(shù)刀片將目的片段DNA瓊脂糖凝膠切下，放入1.5ml離心管中； G2根據(jù)膠塊的重量和濃度，加400 μ I的Buffer B2 ；G3將離心管置于50°C水浴5-10min，間混勻，直至完全溶化； G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2體積1/3的異丙醇，混勻； G5將融化好的溶液吸入吸附柱，8000g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中； G6向吸附柱加入500μ1 Wash solution,9000g離心30sec,倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一個(gè)收集管中； G7重復(fù)步驟G6 —次； G8將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，9000g離心Imin ； G9往吸附膜中央加入20 μ I Elution buffer,室溫靜置l_2min, 9000g離心lmin,將所得到的DNA溶液放入_20°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)； H.回收產(chǎn)物與PMD18-T載體的連接 在PCR管中，用T-Vector與特異性片段進(jìn)行連接，操作步驟如下: Hl 加載體 PMD18-Tly I ； H2加目的DNA片段1-4 μ I ;
Η3 加 Solution I 緩沖液 5 μ I ; Η4加水至10 μ I ; Η5在16°C下連接8小時(shí)以上；.1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Il感受態(tài)細(xì)胞冰上溶化5分鐘,加入待轉(zhuǎn)化的連接液或者質(zhì)粒,冰上靜置30min后； I242°C水浴熱擊60s，冰上冷卻l-2min ； 13加入800 μ ILB培養(yǎng)基，200rpm、37°C振蕩培養(yǎng)Ih ； 14取100 μ I涂板，37°C倒置培養(yǎng)14-16h后挑取單菌落搖菌； 15菌液PCR; J.序列測定及分析 將通過鑒定后，明確已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的離心管中，送上海生工測序; 測定的序列用DNAMAN，BLAST軟件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列進(jìn)行比較分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆山核桃中CcPIP啟動(dòng)子序列的方法，其特征在于，步驟A中DNA提取的步驟為: Al稱取0.5g新鮮嫩芽，在液氮中迅速研磨，至白色粉末狀； A2將粉末轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加入3ml65°C預(yù)熱的pH8.0的CTAB提取液，包括:2%CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl 和 2% PVP，30 μ L β -琉基乙醇，搖勻后 65°C溫浴40min,不時(shí)搖動(dòng)； A3加入3ml的24:1的氯仿:異戍醇混合液，混勻后，室溫12000rpm離心10 min ； A4取上清液于IOml離心管中，重復(fù)步驟A3兩次； A5取上清液于2ml離心管中，加入2ml預(yù)冷的異丙醇，緩慢充分混勻，_20°C靜置Ih ； A6用玻璃鉤撈出沉淀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入70%的乙醇漂洗2_3次； A7棄乙醇，風(fēng)干DNA沉淀，用600 μ I TE緩沖液或ddH20溶解，加入3 μ 110mg/mlRNase，混勻，37°C溫浴`30min ;_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N15/10GK103667293SQ201310642579
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】鄭炳松, 沈憶珂, 何勇清, 方佳, 方仲相, 江波, 司馬曉嬌, 任韡, 王騰飛 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)