利用mTERT和mTyr雙啟動子聯(lián)合調(diào)控HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用mTERT和mTyr雙啟動子 聯(lián)合調(diào)控HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素瘤（melanoma)是一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)病率較低，占惡性腫瘤的 1%~3%，但其惡性度高，轉(zhuǎn)移早且發(fā)生廣泛，是臨床治療過程中頗為棘手的惡性腫瘤。惡 性黑色素瘤具有快速生長W及高死亡率的特點(diǎn)，黑色素瘤的轉(zhuǎn)移往往發(fā)生在腫瘤形成的初 期階段，且轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤侵襲性非常高，傳統(tǒng)的治療方法對其無效或效果很差。由于W 上的種種原因，使得研究者們亟需一種新的研究策略來治療惡性黑色素瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種利用mTERT和mTyr雙啟動子聯(lián)合調(diào)控HN 基因構(gòu)建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應(yīng)用。將兩種啟動子對腫瘤細(xì)胞的祀向性、HN 基因的細(xì)胞調(diào)亡作用和腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來，構(gòu)建出能 夠融合表達(dá)上述基因的重組腺病毒，檢驗(yàn)HN基因在雙啟動子的聯(lián)合調(diào)控作用下對B16細(xì)胞 的抑瘤作用。為進(jìn)一步利用重組腺病毒在體內(nèi)外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡及研制動物腫瘤的廣譜 疫苗奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用mTERT啟動子和 mTyr啟動子調(diào)控HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，包括W下步驟： 陽0化]1)從巧7BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞總RNA和新城疫病毒（NDV) LaSota株感染的雞胚尿囊液中分別擴(kuò)增出mTERT啟動子基因序列GI:AF157502. UmTyr啟 動子基因序列GI:D00439. 1和HN基因序列GI:EF 211815. 1 ;
[0006] 所述的mTERT啟動子基因、mTyr啟動子基因和HN基因的擴(kuò)增包括：W mTERTp-F SEQ ID NO :1和mTERTp-R沈Q ID NO :2為引物，W C57化/6小鼠的胸腺DM為模版，擴(kuò)增 mTERT啟動子；WTy巧-F沈Q ID N0:3和Ty巧-R沈Q ID N0:4為引物，W小鼠黑色素瘤 B16細(xì)胞總RNA為模版，擴(kuò)增mTyr啟動子；W HN-F沈Q ID NO :5和HN-R沈Q ID NO :6為 引物，W新城疫病毒NDV LaSota株感染的雞胚尿囊液為模版，擴(kuò)增HN基因；
[0007] 2)將獲得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-虹GFP-2穿梭載體中，線性化重組穿 梭載體后與骨架載體pAdeasy-1共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，使其在BJ5183內(nèi)進(jìn) 行同源重組，構(gòu)建了包含目的基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;
[0008] 3)將重組腺病毒質(zhì)粒由化C I酶切后，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞，包裝獲得 重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN。
[0009] 所述的利用mTERT和mTyr雙啟動子聯(lián)合調(diào)控HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法制備 的重組腺病毒。
[0010] 所述的利用mTERT和mTyr雙啟動子聯(lián)合調(diào)控HN基因構(gòu)建重組腺病毒的方法制備 的重組腺病毒在防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：將mTERT啟動子對腫瘤細(xì)胞的祀向性、mTyr啟動子對小 鼠黑色素瘤的組織特異性、HN基因的細(xì)胞調(diào)亡作用與腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá) 外源基因的特性相結(jié)合，構(gòu)建表達(dá)上述基因的重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN，使HN基因 在雙啟動的聯(lián)合調(diào)控作用下更好的發(fā)揮其在抑制腫瘤細(xì)胞生長及調(diào)亡方面的作用。通過 對重組腺病毒在B16細(xì)胞中外源基因的蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力和細(xì)胞調(diào)亡的檢測，綜合評價(jià) 了重組腺病毒對B16細(xì)胞的抑瘤作用，研究結(jié)果顯示重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN對 B16細(xì)胞生長的抑制作用在第4d達(dá)到最大值，對B16細(xì)胞的調(diào)亡率為58. 39 + 1. 47%，其 余重組腺病毒均可在不同程度上抑制B16細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，且重組腺病 毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN的抑瘤作用（調(diào)亡率為58. 39 + 1. 47% )顯著優(yōu)于對照組腺病毒 Ad-GFP(調(diào)亡率為19. 05 + 0. 89% ) (P<0. 05)。本發(fā)明最終研制出一種針對動物腫瘤性疾病 的廣譜疫苗。
【附圖說明】
[0012] 圖1是mTERTp、mTy巧和HN基因RT-PCR/PCR擴(kuò)增結(jié)果（M:DL250bp DNA分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)；l:mTERTp基因PCR產(chǎn)物；2:mTy巧基因RT-PCR產(chǎn)物；3:HN基因PCR產(chǎn)物）。 陽01引 圖2是腺病毒穿梭載體的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M :DL 250bp DNA Marker ;1 :mTERT啟 動子片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :mTyr啟動子片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :HN基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；4 :mTERTp-HN基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5 :mTy巧-HN基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6 : mTERTp-mTy巧-HN基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）。
[0014] 圖3是腺病毒穿梭載體雙酶切鑒定結(jié)果（M :DL化b DNA Marker ;1 :pShuttle-HN 經(jīng)化e I和化o I的雙酶切產(chǎn)物；2 :p化uttle-mTERTp-HN經(jīng)Bgl II和化o I的雙酶切產(chǎn) 物；3 :pauittle-mTy巧-HN 經(jīng) Sea I 和化〇 I 的雙酶切產(chǎn)物；4 :pauittle-mTERTp-Ty巧-HN 經(jīng)Bgl II和化0 I的雙酶切產(chǎn)物）。
[0015] 圖4是重組腺病毒質(zhì)粒的電泳結(jié)果（M:DL化b DNA Marker ;1:重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-HN ;2 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mTERTp-HN ;3 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mTy巧-HN ;4 :重組腺 病毒質(zhì)粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;5 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GFP)。
[0016] 圖5是重組腺病毒質(zhì)粒的化CI酶切鑒定結(jié)果（M :DL化b DNA Marker ;1:重 組腺病毒質(zhì)粒pAd-HN的化C I酶切產(chǎn)物；2 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mTERTp-HN的化C I 酶切產(chǎn)物；3 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-mTy巧-HN的化C I酶切產(chǎn)物；4 :重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-mTERTp-Ty巧-HN的化C I酶切產(chǎn)物；5 :重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GFP的化C I酶切產(chǎn)物）。 陽017]圖6是重組腺病毒感染肥K293細(xì)胞巧光檢測圖（10X) (A:正常肥K293 細(xì)胞圖巧：重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細(xì)胞后24h圖；C :重組 腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細(xì)胞感染后24h巧光圖；D :重組腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細(xì)胞感染后72h圖；E :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN 感染肥K293細(xì)胞感染后7化巧光圖）。
[0018] 圖7是是重組腺病毒感染肥K293細(xì)胞后經(jīng)RT-PCR檢測HN基因的結(jié)果（M:DL 250bp DM Marker ;1 :重組腺病毒Ad-HN ;2 :重組腺病毒Ad-mTERTp-HN ;3 :重組腺病毒 Ad-mTy巧-HN ;4 :重組腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN)。
[0019] 圖8是重組腺病毒對B16的細(xì)胞毒作用（20 X) (A :正常B16細(xì)胞圖巧：重組腺病 毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細(xì)胞后2地圖；C :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染 B16細(xì)胞感染后2地巧光圖；D :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細(xì)胞感染后48h 圖；E :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細(xì)胞感染后4化巧光圖；F :重組腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細(xì)胞感染后72h圖；G :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感 染B16細(xì)胞感染后72h巧光圖）。
[0020] 圖9是Western blotting檢測重組腺病毒感染B16細(xì)胞后HN蛋白的表達(dá)情況。
[0021] 圖10是重組腺病毒對B16細(xì)胞的細(xì)胞活力影響研究。
[0022] 圖11是重組腺病毒誘導(dǎo)B16細(xì)胞調(diào)亡作用研究（A.重組腺病毒Ad-GFP ;B.重組 腺病毒Ad-HN ;C.重組腺病毒Ad-mTERTp-HN ;D.重組腺病毒Ad-mTy巧-HN化重組腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN引起的B16細(xì)胞調(diào)亡率）（見表5)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0024] 隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，基因治療現(xiàn)已成為腫瘤學(xué)研 究的熱點(diǎn)。目前，腺病毒（adenovirus, Ad)載體療法是基因治療中最有前景的基因轉(zhuǎn)移方 法之一，它能有效的將外源基