馬鈴薯類t-dna元件與同源轉(zhuǎn)基因體系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本專利屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及25個(gè)馬鈴薯來(lái)源的類"T-DNA"元 件和1個(gè)可應(yīng)用于馬鈴薯及其他植物安全轉(zhuǎn)基因的同源轉(zhuǎn)基因體系及應(yīng)用。其中25個(gè)馬 鈴薯來(lái)源的類"T-DNA"元件及由此構(gòu)建的同源轉(zhuǎn)基因體系在提高馬鈴薯等各類植物轉(zhuǎn)基因 安全性等方面具有顯著功能，可以在植物安全轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球人口飛速增長(zhǎng)，20世紀(jì)60年代起始的"第一次綠色革命"面對(duì)現(xiàn)今60 多億人的吃飯問(wèn)題已不堪重負(fù)。在2010年2月的美國(guó)科促會(huì)（AAAS)年會(huì)上，有專家預(yù)測(cè)， 全球人口總數(shù)將在2050年左右膨脹至90億。然而，在人口快速增長(zhǎng)的同時(shí)，全球可耕種的 農(nóng)地、供使用的淡水和其他農(nóng)業(yè)資源卻沒(méi)有多大的變化。為確保食品安全、減少環(huán)境損害， 突破耕地、水等資源約束，保障全球糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品長(zhǎng)期有效供給，歸根結(jié)底要靠科技創(chuàng) 新和應(yīng)用。推進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研宄與應(yīng)用，是確保全球糧食安全的重要途徑。
[0003] 盡管如此，上個(gè)世紀(jì)末以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭(zhēng) 論?？傮w而言，爭(zhēng)論的焦點(diǎn)主要是無(wú)法完全確定所轉(zhuǎn)移的其他物種基因在受體生物遺傳背 景中的全部表現(xiàn)，特別是來(lái)源于微生物的基因與功能元件序列在植物中的全部表現(xiàn)無(wú)法完 全預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)基因生物一旦進(jìn)入自然環(huán)境，就會(huì)扎根繁衍，加上基因逃逸現(xiàn)象等，一旦確證存 在風(fēng)險(xiǎn)，要從環(huán)境中收回將非常困難(李尉民，岳寧等.轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)與管 理·生物技術(shù)通報(bào)· 2000，4: 41-44)。
[0004] 為提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性，科學(xué)家們近年來(lái)提出了一種新的轉(zhuǎn)基因策略一一內(nèi) 源轉(zhuǎn)基因（Cisgenesis/Intragenisis)。根據(jù)目標(biāo)基因的來(lái)源不同，可以將轉(zhuǎn)基因分為內(nèi)源 轉(zhuǎn)基因（Cisgenesis/Intragenisis)和異源轉(zhuǎn)基因（Transgenesis)，內(nèi)源轉(zhuǎn)基因是利用受 體物種本身或其近緣野生種的基因進(jìn)行遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，異源轉(zhuǎn)基因則是利用不同 物種的功能基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)⑵鋵?dǎo)入到栽培品種中，育成新品種。內(nèi)源轉(zhuǎn)基因所用的基因 即內(nèi)源基因（Cisgene)早已存在于受體同物種或其近緣野生種中，因此并沒(méi)有改變受體物 種的基因庫(kù)。和常規(guī)育種相比，內(nèi)源轉(zhuǎn)基因較常規(guī)育種可以簡(jiǎn)化操作、節(jié)約成本，且并無(wú)額 外的風(fēng)險(xiǎn)，這一觀點(diǎn)在世界各地都達(dá)成了共識(shí)，包括新西蘭、北美和歐洲等國(guó)家的民意調(diào)查 結(jié)果顯示內(nèi)源轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍認(rèn)為可被接受。因此，利用植物本身固有的功能基因采用內(nèi) 源轉(zhuǎn)基因的策略對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良，不僅能夠有效避免異源基因所帶來(lái)的各種風(fēng)險(xiǎn)、打 消公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性的疑慮，而且簡(jiǎn)化了常規(guī)育種繁雜的田間雜交、選擇程序，縮短 育種周期，最終提高作物育種的效率。
[0005] 馬鈴薯是糧、菜、飼料和加工原料兼用的農(nóng)作物，其適應(yīng)性廣、豐產(chǎn)性好、營(yíng)養(yǎng)豐 富、經(jīng)濟(jì)效益高，已成為世界上繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。我國(guó)是世界上 馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)，發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對(duì)于保障我國(guó)糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收和推動(dòng)農(nóng)業(yè) 和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展具有重大的意義。栽培種馬鈴薯iMerios?? L )的遺傳基 礎(chǔ)狹窄，常常需要從野生種和近緣栽培種中引入抗病、優(yōu)質(zhì)基因用于栽培品種的遺傳改良。 但馬鈴薯栽培種為同源四倍體作物，遺傳分離復(fù)雜，且與許多野生種及原始栽培種存在生 殖隔離，因此，傳統(tǒng)的馬鈴薯育種技術(shù)一一雜交育種技術(shù)限制了對(duì)這些寶貴資源的利用。隨 著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和不同學(xué)科間的相互滲透，基因工程育種技術(shù)已經(jīng)融入到馬鈴薯育 種中，產(chǎn)生了一大批靠常規(guī)育種方式難以產(chǎn)生的育種材料，豐富了育種資源、加快了育種進(jìn) 程。特別是近十多來(lái)年，我國(guó)學(xué)者利用基因工程技術(shù)進(jìn)行了馬鈴薯抗病、抗逆及品質(zhì)改良等 多方面的研宄，已經(jīng)取得了一定的成績(jī)，然而，如上所述，公眾對(duì)基因工程改良品種安全性 的擔(dān)心，極大地限制了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的商品化進(jìn)程。
[0006] 為解決馬鈴薯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全隱患，部分學(xué)者已開(kāi)始著手馬鈴薯內(nèi)源轉(zhuǎn)基因技 術(shù)的研宄，現(xiàn)有的報(bào)道大多強(qiáng)調(diào)了目的性狀基因的內(nèi)源性，然而構(gòu)建表達(dá)載體的DNA序列 仍然不能完全使用同源或者近緣物種來(lái)源的DNA序列，許多DNA序列仍然來(lái)源于微生物，例 如：農(nóng)桿菌來(lái)源的T-DNA邊界序列等。轉(zhuǎn)基因載體上的異源序列可以隨目的基因插入到植 物基因組中，其潛在的影響尚無(wú)法估計(jì)，引發(fā)公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全的憂慮?？傮w而言， 目前公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因安全的質(zhì)疑主要包括兩個(gè)方面，一是來(lái)源于不同物種之間的目的性狀基 因相互轉(zhuǎn)化可能產(chǎn)生的威脅，二是轉(zhuǎn)基因載體上的異源DNA序列元件(如農(nóng)桿菌T-DNA序列 等）隨目的性狀基因插入到植物基因組中的潛在威脅。目前對(duì)于同源目的性狀基因的克隆 研宄已有很多，但針對(duì)載體序列的安全性研宄還十分有限。因此，開(kāi)發(fā)更加安全的轉(zhuǎn)基因內(nèi) 源DNA序列元件用于遺傳改良，是包括馬鈴薯在內(nèi)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的當(dāng)務(wù)之急。
[0007] 鑒于內(nèi)源DNA序列元件對(duì)于轉(zhuǎn)基因安全性的重要性，國(guó)際上有些學(xué)者在綜述類文 章中對(duì)其進(jìn)行了一些前瞻性的討論[Conner A J, Barrell P J, et al. · Erasmuson A K, Nap JP, Jacobs J Μ. E. Intragenic vectors for gene transfer without foreign DNA. Euphytica. 2007, 154: 341-353 ；Rommens, C M, Haring M A, et al. . ^The intragenic approach as a new extension to traditional plant breeding. 〃 Trends Plant Sci. 2007，12(9): 397-403]，而且兩個(gè)研宄小組已經(jīng)對(duì)內(nèi)源DNA序列元件做了一些 相關(guān)研宄。新西蘭皇家研宄院作物與食品研宄所的Baldwin等[Baldwin, S.，A. Lokerse, et al. . Intragenic vectors: mining plant EST databases for T-DNA border-like sequences. Proceedings of the 13th Australasian Plant Breeding Conference, Christchurch, New Zealand. 2006 pp. 946-951]通過(guò)分析農(nóng)桿菌 T-DNA 元件，發(fā)現(xiàn)該元 件序列具有兩個(gè)重要的保守結(jié)構(gòu)域，分別用這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域搜尋植物EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，保守 結(jié)構(gòu)域在大多數(shù)植物的轉(zhuǎn)錄本中都廣泛存在，搜索、分析及計(jì)算機(jī)輔助拼接后獲得多條植 物來(lái)源的"T-DNA"序列。經(jīng)內(nèi)源轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，其中部分植物來(lái)源的"T-DNA"序列具有生物學(xué) 功能。Baldwin等研宄的植物"T-DNA"序列雖然完全來(lái)自植物轉(zhuǎn)錄本且具有生物學(xué)功能，但 是由于它們是將兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分別搜索再經(jīng)計(jì)算機(jī)拼接組成，因此，它們能否被定 義為植物來(lái)源的內(nèi)源DNA元件尚有爭(zhēng)議。
[0008] 美國(guó)辛普勞公司的 Rommens 等[1?01111116118，（1]\1，0.13〇1^1'；[，6七&1·· Plant-derived transfer DNAs. Plant Physiol 2005，139 (3) : 1338-49]則根據(jù)農(nóng)桿 菌T-DNA的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，在馬鈴薯、水稻等多個(gè)植物基因組中分別克 隆得到了數(shù)條類"T-DNA"元件，經(jīng)轉(zhuǎn)基因煙草研宄，證實(shí)了 5條馬鈴薯基因組來(lái)源的類 "T-DNA"元件具有起始轉(zhuǎn)移功能。相比農(nóng)桿菌T-DNA起始轉(zhuǎn)移效率，其中4條轉(zhuǎn)移序列起 始轉(zhuǎn)移效率在50%到105%之間。其后Rommens實(shí)驗(yàn)室又繼續(xù)利用這些類"T-DNA"元件構(gòu) 建了馬鈴薯同源轉(zhuǎn)基因體系，并用于轉(zhuǎn)基因改良馬鈴薯的低溫糖化及油炸后高丙烯酰胺 等品質(zhì)[Chawla, R. , R. Shakya, et al. . Tuber-specific silencing of asparagine synthetase-1 reduces the acrylamide-forming potential of potatoes grown in the field without affecting tuber shape and yield. Plant Biotechnol J 2012, 10 (8) :913-24 ；Rommens, C. M. , H. Yan, K. Swords, et al. . Low-acrylamide French fries and potato chips. Plant Biotechnol J 2008, 6 (8) :843-53 ; Rommens, C. M. , C. M. Richael, et al. . Engineered native pathways for high kaempferol and caffeoylquinate production in potato. Plant Biotechnol J 2008, 6 (9):870-86 ； Rommens, C. M. , J. M. Humara, et al. . Crop improvement through modification of the plant's own genome. Plant Physiol 2004, 135 (I):421-31. ]〇
[0009] 綜上所述，雖然已經(jīng)認(rèn)識(shí)到內(nèi)源DNA序列元件的鑒定和利用對(duì)于轉(zhuǎn)基因安全性具 有重要性，但是目前國(guó)際上涉及到的報(bào)道多為綜述類文章，相關(guān)研宄類報(bào)道較少且較初步， 僅Rommens實(shí)驗(yàn)室在該領(lǐng)域做出了一定的研宄成果。然而，Rommens實(shí)驗(yàn)室的研宄中使用 的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增方法并不能夠全面尋找馬鈴薯類"T-DNA"元件，因此，該研宄有待進(jìn)一步全 面展開(kāi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 隨著馬鈴薯基因組測(cè)序框架圖的完成，本發(fā)明人更加系統(tǒng)、全面地分析了馬鈴薯 類"