香菇C91-3菌株的Latcripin-11基因片段、編碼蛋白、制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從香葫C91-3菌株中提取的Zaic_ri/7i/?-77基因片段、編碼蛋白、 制備方法及用途，所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫力、調(diào)節(jié)細胞周期及 抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 真菌富含多種生物活性分子，包括核糖體失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素樣 蛋白、多糖和激酶。其中的抗腫瘤成分以不良反應(yīng)少、療效顯著等優(yōu)點在腫瘤治療方面具有 獨到之處。香菇菌C91-3屬真菌為擔(dān)子菌亞門擔(dān)子菌綱側(cè)耳科，該菌種已于2013年保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 7354。香菇菌C91-3 含有健脾益氣，扶正祛邪，增強機體免疫力，防治癌癥等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et al. An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]. Biochem J， 2003, 374 :321-327]。香菇菌C91-3發(fā)酵液中含有多種蛋白成分，通過動物體內(nèi)實驗證實 有些蛋白成分具有較好的抗腫瘤作用[黃敏，寧安紅，張卓然等.香菇C91-3菌絲發(fā)酵液小 鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研宄[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1996,8 (3) :38-40]。體外實驗也證實， 其發(fā)酵液中的一些蛋白組分具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力[戴兵，黃敏，寧安紅.香菇 C91-3菌絲發(fā)酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細胞株U14生長及誘導(dǎo)凋亡的實驗研宄.浙江醫(yī)學(xué)， 2004, 26 (9) ;656 -658]。雖然目前已有關(guān)于從香菇C91-3菌中提取可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡 的基因片段、編碼蛋白及制備方法的相關(guān)報道，如香菇C91-3菌株的基因片 段等，但是不同的基因片斷的作用效果不盡相同，亟待開發(fā)更多的表達蛋白藥效強、靶向性 好、具備產(chǎn)業(yè)價值的香菇C91-3cDNA的基因片段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種從香菇C91-3菌株 中提取的基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細胞 凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫力、調(diào)節(jié)細胞周期及抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等功能。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種香菇C91-3菌株的L3icri/7i/?-77基因片段，其特征 在于核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0005] -種上述香葫C91-3菌株的Zaic_ri/7i/?-77基因片段編碼蛋白，其特征在于氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] -種上述香葫C91-3菌株的Zaic_ri/7i/?-77基因片段的制備方法，其特征在于依次 按如下步驟進行： a. 提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA ; b. 將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ; c. PCR擴增目標(biāo)基因： 以所得到的cDNA為模板、以具有BamH I和Xho I兩個酶切位點的PCR反應(yīng)引物進行 PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如下： 上游引物BamH I : 5'-GGCTGATATCGGATCCCTCGGCTCTTTCCTTCCCG-3' 下游引物Xho I : 5'-GGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTCGGCTCTAGCAAAA-3， d.回收純化DNA片段： 將所得到的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化5900bpMarker附近的明顯條帶，切 膠回收DNA片段。
[0007] 所述a步驟是取培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研 磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min 后，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩 后，4°C，12000 r/min離心，15 min;吸取上層水相溶液并轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體 積異丙醇，混勾后室溫靜置15 min，再次4°C，12000 r/min離心，10 min，棄上清，然后加入 75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。
[0008] 所述c步驟的PCR反應(yīng)體系50 μL : cDNA模板1 μL，上游引物0. 5 μL，下游引 物 0.5 μL，dNTP Mixture (各 2.5 mM) 4 Pl、5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL、 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2· 5 U/μΙ) 0· 5 μL、滅菌蒸餾水 33. 5 μL ;反應(yīng)條件：98°C 變性 10 s，55°C復(fù)性 10 s，72°C延伸 I min，30 個循環(huán)；72°C延伸 5 min ;4°C冷卻 10 min。
[0009] -種上述香葫C91-3菌株的Zaic_ri/7i/?-77基因片段編碼蛋白在制備抗腫瘤、抗氧 化或抗衰老藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明是從香菇C91-3菌絲體轉(zhuǎn)錄組中，克隆出一段特異性基因片段，命名為 基因片段，該基因片段所編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫 力、調(diào)節(jié)細胞周期及抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等功能?？蓪⒃摶蚱芜M行基因重組，并于 pET-32a原核表達體系中進行高效表達，將表達產(chǎn)物通過親和層析進行分離和提純，獲得該 基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白可用于研宄細胞凋亡中的機制及其在細胞信號通路中的作用， 也可用于制備治療腫瘤、抗氧化或抗衰老藥物，增加藥物種類。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明實施例PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明實施例所用載體pET_32a (+)雙酶切后的電泳圖。
[0013] 圖3是本發(fā)明實施例提取的基因片段轉(zhuǎn)化后的單克隆陽性菌落。
[0014] 圖4是本發(fā)明實施例重組表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
[0015] 圖5是本發(fā)明實施例誘導(dǎo)表達蛋白的Western-blot電泳圖。
[0016] 圖6是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0017] 圖7是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白對腫瘤細胞的24小時生長抑制率示意圖。
[0018] 圖8是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白對腫瘤細胞的48小時生長抑制率不意圖。
[0019] 圖9是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白的清除氧自由基率不意圖。
[0020] 圖10是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白對U937細胞的抗氧化能力（SOD)示意圖。
[0021] 圖11是本發(fā)明實施例純化后的目標(biāo)蛋白對HL60、U937細胞的總抗氧化能力 (T-AOC)示意圖。
[0022] 香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日； 分類命名香賽 QLentinula edodes) 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC); 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 保藏號：CGMCC No. 7354。
【具體實施方式】
[0023] a.提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA : 取用培養(yǎng)基培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入 Iml的Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后， 12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，然后加入然后加入0. 2 ml氯仿，溫和 振蕩后，4°C，12000 r/min離心，15 min;吸取上層水相溶液0.5 ml并轉(zhuǎn)移至另一干凈的 1.5 ml離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勾后室溫靜置15 min，再次4°C, 12000 r/min 離心，10 min，棄上清，然后加入75%乙醇I ml洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，香菇 C91-3菌株的菌絲體總RNA ; 紫外分光光度計驗證純度，0D260/280比值在I. 8~2. 0之間。
[0024] 進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，表明RNA提取純度較高。
[0025] b.將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ; 使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver. 2.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，本試劑盒購 自寶生物工程(大連）有限公司。
[0026] 反應(yīng)體系：香菇菌絲體總 RNA (lPg/^l) 1 μ1、3' RACE Adaptor (5 μΜ) 1 μL、 dNTP Mixture (10 mM each) I M-KRNase Free dH20 4.5 M-I ； 反應(yīng)條件：70°C，10 min立即冰上放置2分鐘； 然后加入下列組分：5X M-MLV Buffer 2μ1、RNase Inhibitor (40 U/μΙ) 0.25 μL、 Reverse Transcriptase M-MLV (無 RNA酶）（200 U/μΙ) 0.25 μL，體系總體積達到 10 μL。
[0027] 反應(yīng)條件：42°C，60 min 70°C，15 min得到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA)。
[0028] c. PCR擴增目標(biāo)基因： 以所得到的cDNA為模板、以具有BamH I和Xho I兩個酶切位點的PCR反應(yīng)引物進行 PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如下： 上游引物BamH I : 5'-GGCTGATATCGGATCCCTCGGCTCTTTCCTTCCCG-3' 下游引物Xho I : 5'-GGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTCGGCTCTAGCAAAA-3， 引物委托寶生物(大連）公司合成。
[0029] PCR反應(yīng)體系50 μL : cDNA模板1 μL，上游引物0· 5 μL，下游引物0· 5 μL，dNTP Mixture (各 2.5 mM) 4 Pl、5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 υ/μ1)0·5 μL、滅菌蒸饋水 33.5 μL;反應(yīng)條件：98°C變性 10 s，55°C復(fù)性 10 s，72°C延伸 I min，30 個循環(huán)；72°C延伸 5 min ;4°C冷卻 10 min。
[0030] PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳如圖I所示，圖I中M : DL2, 000 DNA Marker ;1 : L3 目的克隆片段產(chǎn)物，證明成功獲得了該基因片段。
[0031] d.回收純化DNA片段： 將所得到的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化357bpMarker附近的明顯條帶，切 膠回收DNA片段，命名為Za icri/7i/7-77基因片段。
[0032] 實驗： 1. L3icri/?i/7-77基因片段序列測定： 測序由大連寶生物公司測定，香菇C91-3 基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 1。Latcripin-Il的基因片段序列長為357bp的cDNA，其含有119個密碼子可讀框 (0RF)。經(jīng)使用NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸相似性檢索表明，無任何相似性的基因片段序列，證明此 基因為一新型基因片段。
[0033] 2. L3icri/?i/7-77基因片段的克隆表達 2. 1載體構(gòu)建 2. L 1將質(zhì)粒pET-32a (+)，使用BamH I /Xho I進行酶切； 反應(yīng)體系（37°C過夜）： pET-32a (+) (100 ng/μL) 10 μL IOXK Buffer 5 μL BamH I (10 U/μΙ) 1 μL Xho I (10 U/μΙ) 1 μL dH20 Up to 50 μL 取5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，M : λ-Hind III digest;l : pET-32a (+)