編碼hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說，涉及人乳頭瘤病毒編碼及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭狀瘤病毒（human papilkgna virus, HPV)是一種致瘤DNA病毒，可引起人 生殖道和肛門皮膚、黏膜發(fā)生良性和惡性腫瘤，其中與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)的有HPV 16, 18 等。每年全世界宮頸癌的新增病例約為50萬人，死亡人數(shù)近30萬，是威脅女性健康的第二 大癌癥。
[0003] 有80種以上的人乳頭瘤病毒，即HPV。其中很多與各式各樣的生物學(xué)表型相關(guān)， 所述生物學(xué)表型為從良性增生性疣到惡性癌。HPV6和HPVll是與生殖器或呼吸粘膜的良 性疣、非惡性尖銳濕疣和輕度發(fā)育不良相關(guān)的最普通類型。HPV16和HPV18是與子宮頸、陰 道、女陰和肛管的原位和侵襲性癌最常相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)類型。90%以上的子宮頸癌與HPV16、 HPV18或較少流行的致癌類型HPV31、-33、-45、-52和-58的感染相關(guān)。在對(duì)90%以上子 宮頸癌中檢測(cè)到HPV DNA的觀察結(jié)果提供了 HPVs引起子宮頸癌的強(qiáng)大流行病學(xué)證據(jù)。人 乳頭瘤病毒是?。?0-60nm)、無包膜、二十面體的DNA病毒，其編碼最多8個(gè)早期和2個(gè)晚 期基因。該病毒基因組的可讀框命名為El至E7,和Ll和L2,其中E表示早期L表示晚期。 Ll和L2編碼病毒衣殼蛋白，而E基因與病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能相關(guān)。Ll蛋白是主要 的衣殼蛋白，并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣殼蛋白。免疫學(xué)數(shù)據(jù)提示在病 毒衣殼中，大多數(shù)L2蛋白位于Ll蛋白內(nèi)部。在不同人乳頭瘤病毒中，Ll和L2蛋白是高度 保守的。Ll蛋白或Ll和L2蛋白組合在酵母、昆蟲細(xì)胞、脯乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌中的表達(dá)導(dǎo)致 病毒樣顆粒（VLPs)的自動(dòng)裝配。VLPs形態(tài)上類似于真的病毒體且在施用于動(dòng)物或人后能 夠誘導(dǎo)高效價(jià)的中和抗體。因?yàn)閂LPs不會(huì)有潛在地致癌病毒基因組，所以它們?yōu)榛畈《驹?HPV疫苗開發(fā)中的用途提供了安全的備選方案。由于這個(gè)原因，Ll和L2基因已經(jīng)被確定為 HPV感染和疾病的預(yù)防和治療性疫苗開發(fā)的免疫學(xué)靶。
[0004] 在亞洲地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，52、58型就與30%以上的宮頸癌相關(guān)。在正常 人群中HPV52的流行程度僅次于HPV16,約為2. 42%，在宮頸糜爛患者中也占有一定的比例 (略低于HPV58)，但在浸潤(rùn)性子宮頸癌中，HPV52的流行度卻大大降低，這可能與HPV52E7癌 蛋白的轉(zhuǎn)化能力有限有關(guān)。宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)由宮頸糜爛引發(fā)的漸進(jìn)過程，而HPV52又 是宮頸糜爛發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素，因此針對(duì)HPV52亞型的免疫保護(hù)反應(yīng)對(duì)于宮頸癌 的預(yù)防性疫苗有著重要的意義。
[0005] 與在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物中獲得高表達(dá)水平的衣殼蛋白、限制純化蛋白的生產(chǎn)相 關(guān)的困難已阻礙了 HPV疫苗開發(fā)和商業(yè)化。因此，盡管鑒定了編碼HPV58L1蛋白的野生型 核苷酸序列，但是非常期望開發(fā)出HPV58L1蛋白的可容易更新來源，該蛋白利用在制定宿 主細(xì)胞中表達(dá)被最優(yōu)化的編碼HPV58L1的核苷酸序列。另外，產(chǎn)生具有天然蛋白的賦予免 疫性質(zhì)的用于疫苗開發(fā)的大量HPV58L1VLPS將很有用處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)HPV疫苗中使用的蛋白種類和活性 的問題，提供編碼HPV58L1或HPV52L1蛋白的核苷酸序列，通過密碼子優(yōu)化使其能夠在酵母 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)；同時(shí)通過表達(dá)在酵母細(xì)胞中產(chǎn)生HPV52L1或HPV58L1病毒樣顆粒 (VLPs)，以用于疫苗的研發(fā)。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0008] 編碼HPV52L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。
[0009] 編碼HPV58L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列。
[0010] 一種載體，含有編碼上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者編碼HPV58L1蛋白的核 苷酸序列。
[0011] 一種真核漢遜酵母工程菌，以含有編碼上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者編 碼HPV58L1蛋白的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)染真核漢遜酵母菌株RB-11，經(jīng)篩選得到表達(dá)水平 和質(zhì)粒拷貝數(shù)最高的菌株來獲得。
[0012] RB-Il細(xì)胞株為L(zhǎng)R9細(xì)胞株的改良衍生株（Roggenkamp.R etal.,1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202:302) 〇RB-11細(xì) 胞株為5'-乳清酸苷磷酸脫羧酶基因缺陷性突變株，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)重組菌的構(gòu)建。
[0013] 利用甲醇對(duì)轉(zhuǎn)染后的真核漢遜酵母菌株RB-Il進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在整個(gè)過程中溫度 為28-32°C，時(shí)間為72h，開始時(shí)甲醇用量為細(xì)胞懸浮液質(zhì)量的0. 5%，每間隔24h，向細(xì)胞 懸浮液中添加甲醇，添加甲醇的量為細(xì)胞懸浮液質(zhì)量的0. 5%。
[0014] 利用真核漢遜酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵的方法，在發(fā)酵過程中，所述真核漢遜酵母工 程菌經(jīng)過生長(zhǎng)時(shí)相、去阻遏時(shí)相和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)相，其中一個(gè)質(zhì)量份為Ig :
[0015] (1)生長(zhǎng)時(shí)相：發(fā)酵罐pH值控制在5. 4-5. 5,發(fā)酵溫度控制在28-32°C，使用的發(fā) 酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，由NH4H2PO 4HO -180質(zhì)量份、MgSO4 · 7H20 40- 50質(zhì)量份、KCl 40- 45質(zhì)量份、NaCl 4- 5質(zhì)量份、甘油500- 550質(zhì)量份，發(fā)酵消泡劑4一5質(zhì)量份和去離子 水10000-15000質(zhì)量份組成；在生長(zhǎng)時(shí)相中，發(fā)酵罐內(nèi)溶氧會(huì)緩慢下降，當(dāng)下降至60%時(shí)， 向發(fā)酵罐中勻速打入補(bǔ)料培養(yǎng)基，使用的補(bǔ)料培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，由NH 4H2P0480 - 90質(zhì)量 份、甘油250- 300質(zhì)量份和去離子水500- 550質(zhì)量份組成；當(dāng)發(fā)酵罐溶氧水平降至40% 以下時(shí)，將空氣流量由起初的25- 30L/min調(diào)至12 - 15L/min，攪拌轉(zhuǎn)速由起初的1200- 1500rpm調(diào)至700rpm ;整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)相時(shí)間在20-25小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，發(fā)酵罐溶氧水 平可下降至20 %以下，細(xì)胞0D_達(dá)到80以上；
[0016] (2)去阻遏時(shí)相：當(dāng)發(fā)酵罐溶氧由最低點(diǎn)回升到60%以上時(shí)，進(jìn)入去阻遏時(shí)相， 維持空氣流量和攪拌條件不變，加入去阻遏培養(yǎng)基；所述去阻遏培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，由 NH4H2P0425- 30 質(zhì)量份、MgSO4WH2O 5-10 質(zhì)量份、KCl 5-8 質(zhì)量份、NaCl 0.5- 1 質(zhì)量份、 甘油1700- 1900質(zhì)量份和去離子水1200-1350質(zhì)量份組成，去阻遏時(shí)相持續(xù)20- 25h ;
[0017] (3)誘導(dǎo)時(shí)相：去阻遏時(shí)相之后進(jìn)入誘導(dǎo)時(shí)相，向發(fā)酵罐中補(bǔ)加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述 誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，由甘油和甲醇組成，甘油和甲醇的體積比為（38- 40) : (60- 65)， 調(diào)控甲醇的用量，以使甲醇在整個(gè)發(fā)酵罐的液相體積中，體積百分比為〇. 3%-0. 5%，誘導(dǎo) 時(shí)相持續(xù)48- 55h。
[0018] 在生長(zhǎng)時(shí)相中，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選由NH4H2PO4HO - 175質(zhì)量份、MgSO4 · 7H20 40- 45 質(zhì)量份、KCl 42- 44質(zhì)量份、NaCl 4. 2 - 4. 4質(zhì)量份、甘油520- 540質(zhì)量份，發(fā)酵消泡劑 4一5質(zhì)量份和去離子水10000-12000質(zhì)量份組成，所述發(fā)酵消泡劑為THIF - 298型生物 發(fā)酵消泡劑。
[0019] 在生長(zhǎng)時(shí)相中，補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)選由NH4H2P0485 - 87質(zhì)量份、甘油260- 280質(zhì)量份 和去離子水520- 540質(zhì)量份組成。
[0020] 在生長(zhǎng)時(shí)相中，補(bǔ)料培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為（0. 8 -1) ： (10一12) 〇
[0021] 在去阻遏時(shí)相中，去阻遏培養(yǎng)基優(yōu)選由NH4H2P0 426 - 28質(zhì)量份、MgSO4 · 7H20 6- 8質(zhì)量份、KCl 7- 8質(zhì)量份、NaCl 0. 6- 0. 8質(zhì)量份、甘油1750- 1850質(zhì)量份和去離子水 1300-1350質(zhì)量份組成。在去阻遏時(shí)相中，發(fā)酵培養(yǎng)基和去阻遏培養(yǎng)基的體積比為4 :(1一 1. 2) 〇
[0022] 在誘導(dǎo)時(shí)相中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的使用體積為去阻遏培養(yǎng)基體積的30- 40%。
[0023] 本發(fā)明利用野生型基因，在充分考慮真核漢遜酵母菌株RB-Il的表達(dá)特點(diǎn)的基礎(chǔ) 上，提供了兩種新的核苷酸序列，編碼HPV52L1蛋白或HPV58L1蛋白，在構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)染 RB -11之后，誘導(dǎo)發(fā)酵得到的產(chǎn)物中形成各自的VLPs，并且表達(dá)量明顯高于野生型基因的 表達(dá)水平，且能夠作為疫苗進(jìn)行使用。
【附圖說明】
[0024] 圖1是表達(dá)載體pMPT - HPV52L1的構(gòu)建示意圖。
[0025] 圖2是表達(dá)載體pMPT - HPV58L1的構(gòu)建示意圖。
[0026] 圖3是表達(dá)載體pMPT - HPV58L1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后PCR擴(kuò)增的電泳照片。
[0027] 圖4是HPV58L1的轉(zhuǎn)化子west - blot方法篩選結(jié)果圖。
[0028] 圖5是懸浮緩沖液中HPV58L1 VLPs圖像。
[0029] 圖6是懸浮緩沖液中HPV52L1 VLPs圖像。
[0030] 圖7是野生基因與優(yōu)化基因的酵母表達(dá)VLPs量的對(duì)比示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0032] 實(shí)施例1編碼HPV52L1或HPV58L1蛋白的核苷酸序列的合成
[0033] 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索得到HPV52L1和HPV58L1的野生型DNA序列和蛋白質(zhì) 序列，其中對(duì)HPV52L1來說，野生型DNA序列HPV52L1-WT全長(zhǎng)1512個(gè)堿基，蛋白質(zhì)序列 Genbank登記號(hào)為HQ537731. 1，蛋白質(zhì)序列全長(zhǎng)504個(gè)氨基酸。