一種在高山被孢霉中表達(dá)異源ω-3脫飽和酶的重組菌株及其構(gòu)建方法
【專利說(shuō)明】一種在高山被孢霉中表達(dá)異源ω-3脫飽和酶的重組菌株及其 構(gòu)建方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種在高山被孢霉中過(guò)表達(dá)來(lái)源于瓜果腐霉的ω -3脫飽和酶 〇PaFADS17的基因工程菌株及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 高山被孢霉(Mortierella alpina)是一種脂質(zhì)積累可以達(dá)到細(xì)胞干重50%的產(chǎn) 油真菌，是脂質(zhì)生物化學(xué)基礎(chǔ)研究的重要模式生物。高山被孢霉已經(jīng)被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn) 花生四烯酸(Arachidonic &(^(^4,020:4)，其生產(chǎn)的食用油脂已經(jīng)通過(guò)美國(guó)農(nóng)業(yè)部$0八） 的安全性評(píng)估。除了合成AA之外，高山被孢霉也具有一定的合成二十碳五烯酸 (Eicosapentanoic acid，EPA, C20 : 5)的能力。EPA屬于ω -3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs)，具有重要的生理功能，如：促進(jìn)哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育以及神經(jīng)組織形成和修復(fù)的能 力，預(yù)防哮喘、癌癥、抑郁、肥胖、免疫紊亂以及心血管疾病等。但是人體自身不能合成這些 脂肪酸，需要從富含ω -3LC-PUFAS的食物(如深海魚油）中攝取。而深海魚類提供的ω -3LC-PUFAs存在穩(wěn)定性差、純化工藝復(fù)雜、易氧化等缺點(diǎn)，且由于大肆捕撈和環(huán)境污染破壞，深海 魚類提供的《-3LC_PUFAs已無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，所以利用微生物生產(chǎn)ω-3LCPUFAs已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
[0003] 由ΑΑ合成ΕΡΑ的反應(yīng)是通過(guò)ω -3脫飽和酶催化完成的。不同物種來(lái)源的ω -3脫飽 和酶對(duì)催化的底物具有明顯的偏好性，其中偏好催化20碳PUFAs的ω -3脫飽和酶可以較高 效的催化ΑΑ生成ΕΡΑ，對(duì)于ΕΡΑ的生產(chǎn)有十分重要的作用。2004年，Pereira等人發(fā)現(xiàn)來(lái)源于 異枝水霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶sddl7,對(duì)18碳的多不飽和脂肪酸沒(méi)有催化活性，卻能將20 碳的AA催化為EPA，轉(zhuǎn)化率為25.9%。同樣的，來(lái)源于致病疫霉的ω-3脫飽和酶0ΡΙΝ 17也不 能以18碳的多不飽和脂肪酸為底物，但是對(duì)ΑΑ的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 30.94%。
[0004] 更高的催化ΑΑ生成ΕΡΑ的轉(zhuǎn)化率是本領(lǐng)域想要獲得的，同時(shí)還期望能夠降低生產(chǎn) 的工藝條件(例如由較早的低溫培養(yǎng)提升為對(duì)工藝條件要求較低的常溫培養(yǎng)）。例如中國(guó)發(fā) 明專利申請(qǐng)CN2015109088953公開(kāi)了一株異源表達(dá)來(lái)源于細(xì)小微胞藻CCMP1545的MpFADS6 基因的重組高山被孢霉菌株，根據(jù)其說(shuō)明書的記載，該菌株在常溫培養(yǎng)7天后，ΕΡΑ產(chǎn)量達(dá)到 62.2mg/L，顯著高于野生型高山被孢霉。而當(dāng)采用變溫培養(yǎng)時(shí)（同時(shí)延長(zhǎng)低溫培養(yǎng)時(shí)間），其 EPA產(chǎn)量能夠進(jìn)一步提高至80. lmg/L。然而，常溫環(huán)境下該EPA產(chǎn)量依然不能達(dá)到本領(lǐng)域技 術(shù)人員的期望
[0005] 通過(guò)過(guò)表達(dá)異源ω -3脫飽和酶基因以進(jìn)一步提高重組菌中ω -3脂肪酸EPA的產(chǎn) 量，這對(duì)產(chǎn)油真菌高山被孢霉的基礎(chǔ)理論研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要的意義。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的方法構(gòu)建一株過(guò)表達(dá)來(lái)源于瓜果腐霉 的〇PaFADS17基因的重組高山被孢霉工程菌株，該菌株能夠在常溫環(huán)境下高產(chǎn)ΕΡΑ，以及在 高山被孢霉中過(guò)表達(dá)oPaFADSl 7基因的方法。
[0007] 本發(fā)明還涉及將所述重組高山被孢霉工程菌株用于高轉(zhuǎn)化率地工業(yè)生產(chǎn)EPA。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株過(guò)表達(dá)ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因的重組 高山被抱霉(Mortierella alpina)MA-〇PaFADS17_3，該菌株于2015年10月12日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 11394。
[0009] 在本發(fā)明中，所述ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的來(lái)源于瓜果腐霉的 ω-3脫飽和酶基因，其核酸序列如SEQ NO. 1所示。
[0010] 在本發(fā)明中，所述重組高山被孢霉菌株是以含ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因的根 瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的，特別是用含有ω-3脫飽和 酶oPaFADS17基因的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PaFADS17轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì) 粒pBIG2-ura5s-〇PaFADS17的根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而 成的。
[0011] 另一方面，構(gòu)建上述重組高山被孢霉的方法包括以下步驟：
[0012] a)根據(jù)高山被孢霉密碼子偏好性，優(yōu)化已知的ω-3脫飽和酶PaD 17序列，命名為 oPaFADSl7；
[0013] b)人工合成優(yōu)化后的ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因，如SEQ N0.1所示；
[0014] c)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBIG2-ura5s-〇PaFADS17;
[0015] d)用構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PaFADS17轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌；
[0016] e)用含重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PaFADS17的根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株；
[0017] f)篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株，獲得過(guò)表達(dá)ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因的重組高山被孢 霉菌株。
[0018] 在本發(fā)明中，所述步驟d)的根瘤土壤桿菌(也被稱為根癌農(nóng)桿菌)為根瘤土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇
[0019] 特別地，上述步驟e)的高山被孢霉尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株是中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN 201310347934.8中公開(kāi)的高山被孢霉MAUI，該菌株于2013年11月01日保藏于中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.8414。該高山被孢霉尿嘧啶營(yíng)養(yǎng) 缺陷型菌株也保存于江南大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室，被命名為CCFM501。
[0020] 根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟f)中篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株的方法包括以下步驟：
[0021 ] 1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個(gè)無(wú)菌1.5mL離心管中，過(guò)25μηι濾膜；
[0022] 2)用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度108個(gè)每100yL、10 6個(gè)每100yL、104 個(gè)每100yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上， 25°C避光培養(yǎng)2-3d;
[0023] 3)隨時(shí)用無(wú)菌鑷子挑出生長(zhǎng)的真菌菌絲于含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素，lOOyg/mL頭孢 噻肟的SC-CS平板上，25°C培養(yǎng)2-3d;
[0024] 4)觀察高山被孢霉在平板上的生長(zhǎng)情況，挑出在SC-CS平板上生長(zhǎng)的菌絲接種于 GY斜面上；
[0025] 5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0026] 6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過(guò)表達(dá)ω-3脫飽和酶〇PaFADS17基因的重組高山被孢 霉菌株，保藏于GY斜面上；
[0027] 7)提取含有ω-3脫飽和酶oPaFADS17基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設(shè) 計(jì)一對(duì)與啟動(dòng)子和終止子特異性結(jié)合的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證：
[0028] PI (sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0029] P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0030] 8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。
[0031] 特別地，該高山被孢霉工程菌株是用含有ω-3脫飽和酶基因的重組質(zhì)粒pBIG2_ ura5s-〇PaFADS17轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2_ura5s_oPaFADS17的根瘤土 壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。
[0032] 在本發(fā)明中，重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-〇PaFADS17的構(gòu)建可參考中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng) CN 201310524221.4中公開(kāi)的內(nèi)容。根據(jù)該申請(qǐng)的記載，首先用PCR的方法從pD4質(zhì)粒上獲得 HPH表達(dá)單元，將HPH表達(dá)單元用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切，插入到EcoR I和Xba I 酶切過(guò)的pET28a( + )的多克隆位點(diǎn)(MCS)中，得到質(zhì)粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉 cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶;OPRTase)基因，并利用限制性內(nèi)切酶BspH I和 BamH I酶切ura5基因，將酶切過(guò)的ura5基因插入到Nco I和BamH I酶切過(guò)的質(zhì)粒pET28a_ HPHs中，以替換的hpt基因，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ura5s。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切質(zhì) 粒pET28a_ura5s得到ura5s表達(dá)單元。將ura5s表達(dá)單元替換質(zhì)粒pBIG2RHPH2中的HPH表達(dá) 單元，進(jìn)一步構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2_ura5s。更進(jìn)一步地在質(zhì)粒pBIG2_ura5s和質(zhì)粒 pET28a-HPHs的基礎(chǔ)上，構(gòu)建高山被孢霉基因操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基 因組中獲得非編碼的內(nèi)含子DNA片段IT。用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別對(duì)IT基因片段 和質(zhì)粒pET28a-HPHs進(jìn)行酶切，并通過(guò)連接反應(yīng)將IT片段取代質(zhì)粒pET28a-HPHs的hpt基因， 得到質(zhì)粒pET28a-ITs。用限制性內(nèi)切酶Spe I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pET28a-ITs得到ITs表達(dá) 單元。將ITs表達(dá)單元插入到Xba I酶切過(guò)的質(zhì)粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作 通用載體pBIG2-ura5s-ITs。然后通過(guò)基因工程技術(shù)將ω-3脫飽和酶基因插入高山被孢霉 通用載體pBIG2_ura5s_ITs中，構(gòu)建二元表達(dá)載體pBIG2_ura5s-〇PaFADS17。