利用人工合成mv3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合成MV3序列 培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘蔗花葉病是一種世界性病害，對(duì)南、北美洲甘蔗產(chǎn)量的影響達(dá)30 %~40 %，嚴(yán) 重時(shí)可達(dá)60 %~80%，對(duì)南非甘蔗產(chǎn)量的影響達(dá)10 %~50%，對(duì)印度甘蔗產(chǎn)量的影響 達(dá)10%~15%，在我國(guó)蔗區(qū)也普遍發(fā)生，華南各地區(qū)尤其是廣西旱地甘蔗花葉病的發(fā)病 株率達(dá)到30%以上，產(chǎn)量損失3%~50%。該病病原主要為甘蔗花葉病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花葉病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV)，屬馬鈴暮 Y 病毒屬 (Potyvirus)成員，為單鏈正義RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，編碼10個(gè)成熟蛋白，分別為Pl、 HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。研宄者先后將單一的CP及HC全序列基因 導(dǎo)入到甘蔗中，并獲得了對(duì)甘蔗花葉病的抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因甘蔗。但研宄表明，蔗區(qū)中 花葉病毒的優(yōu)勢(shì)株系在自然條件下也會(huì)發(fā)生變化，并產(chǎn)生新的株系。目前，世界蔗區(qū)至少存 在有7個(gè)ScMV和SrMV病毒株系，包括屬于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和屬于SrMV的株系 SrMV-H，I，M。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基因?yàn)榘袠?biāo)的轉(zhuǎn)基因改良顯然無(wú)法應(yīng) 對(duì)蔗區(qū)病原株系多樣化、復(fù)雜化以及優(yōu)勢(shì)株系的變化。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致革E1基因的表達(dá) 沉默從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象，而且，引發(fā)RNAi 的片段并不需要完整的基因序列，還可以是多個(gè)病毒的不同基因片段的嵌合體，為此，我 們將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行多序 列比對(duì)，從中各選取1條100%同源的序列區(qū)段，采用人工合成的方式串聯(lián)在一起，作為 RNAi (RNA interference)干擾片段，構(gòu)建反向重復(fù)序列，得到一個(gè)RNAi載體。通過(guò)基因槍 轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得具有沉默病毒基因表達(dá)效果的轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0004] 專(zhuān)利號(hào)為ZL20071009226. 8的發(fā)明專(zhuān)利"利用SrMV-Pl基因培育抗花葉病甘蔗品 種的方法"，介紹了一種利用SrMV-Pi基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)Pi基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P :基因材料的培育 以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用人工合成序列MV3培育抗花葉病甘蔗 品種的方法。針對(duì)現(xiàn)有蔗區(qū)甘蔗花葉病嚴(yán)重的問(wèn)題，人工合成可同時(shí)沉默甘蔗花葉病毒和 高粱花葉病毒的新型核酸序列，構(gòu)建RNAi載體，通過(guò)基因槍轟擊法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得對(duì) 花葉病高抗的轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的。
[0007] 本發(fā)明的利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV3序列的 人工合成、RNAi載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于：
[0008] (1)MV3序列的人工合成：
[0009] 從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯(lián)在一起，獲得MV3序列，同時(shí)在正義鏈 5'端加入Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點(diǎn)，采用人工 合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：
[0010]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV3序列的人工合 成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于： (1) MV3序列的人工合成： 從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯(lián)在一起，獲得MV3序列，同時(shí)在正義鏈Y 端加入Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)，反義鏈5'端加入Cla I和Kpn I酶切位點(diǎn)，采用人工合 成的方式，獲得目的片段A，其序列如下： GATCTAGACT CGAGATGGAA AAAAGTTACG TCGATCTCTT AAACCAAGCA TGGGCAGATT TGCCATTACA TTCAAAATTA TATTCAATTT GGCGTGTGTA CGAAGTCAAG AAATATTACA AGCCGTGCTT AGTCCTGAAA AGAGGCGTAG ATTTAGGCGC AATGTACAAT ATCTCAGCTA CGCATCAAAT ATCAAGTTTA GTGCAGAAAA GTCGAGATCA AGTCAGCTCT ATTTCAACCA AACTCCACCA CAGTTTATGT AATAATGGAA AAAAATTATG TAGATCAATT AAACCAGTCA TGGGCAGAAT TATCATACTG TGGAAAATTT TCAGCAATAT GGCGTGTGTT CAGAGTCAAG AAATACTACA AGCCATCTTT AACCGTGAGA AAAAGCGTAG ATTTAGGCGC TGTTTACAAT ATATCAGCTA CGCATCTAAT ATCAGATTTA GTGCAGAGAA GTCGAGATCG AGTCAGCTCT ACTTTAACCA AACTCCGCAA CGGTTTCTAG GTACCATCGA TAG ； (2) RNAi載體構(gòu)建： (a) 目的片段I的獲得：利用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和Kpn I將目的片段A進(jìn)行酶切，將 酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段I ;目的片段I的序列為序列表中 SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； (b) 目的片段II的獲得：將pHANNIBAL載體質(zhì)粒DNA用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和Kpn I進(jìn) 行酶切，將酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段II，目的片段II的序列為 序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； (c) 中間載體B的獲得：將回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA連接酶進(jìn)行連 接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，獲得中間載體B ;所述中間 載體B是指將目的片段I插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體； ⑷目的片段III的獲得：提取中間載體B的質(zhì)粒DNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶Cla I和Xba I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段III ;目的片段III的序 列為序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (e) 目的片段IV的獲得：將目的片段A用限制性?xún)?nèi)切酶Cla I和Xba I進(jìn)行酶切，將酶 切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段IV ;目的片段IV的序列為序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； (f) 中間載體C的獲得：將回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA連接酶進(jìn)行連 接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，獲得中間載體C ;所述中間 載體C是指將目的片段IV插入到中間載體B后獲得的載體； (g) 目的片段V的獲得：提取中間載體C的質(zhì)粒DNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶Not I進(jìn)行酶 切，將酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段V ;目的片段V的序列為序列 表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； (h) 目的片段VI的獲得：將植物表達(dá)載體pGreenII0229質(zhì)粒DNA用限制性?xún)?nèi)切酶Not I進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收目的片段VI ;目的片段VI的序 列為序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列； ⑴抗甘蔗花葉RNAi載體pG0229i-MV3的獲得：將回收的目的片段V和目的片段VI用 T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a中，挑取陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，獲得 可用于遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗受體材料的RNAi載體pG0229i-MV3 ; (3)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構(gòu)建完成的RNAi載體 pG0229i-MV3質(zhì)粒DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，并將其定量至I y g/ y 1，基 因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，分子檢測(cè)獲得再生陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗的 抗病性鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法， 其特征在于所述從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯(lián)在一起，即將收集到的ScMV各 病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進(jìn)行多序列比對(duì)，從中各選取1條 100%同源的序列區(qū)段串聯(lián)在一起，共495bp。
【專(zhuān)利摘要】一種利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV3序列的人工合成、RNAi干擾載體構(gòu)建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育和抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗病性鑒定。本發(fā)明獲得的植物表達(dá)載體采用了RNAi技術(shù)，使得甘蔗抗病毒育種擺脫了對(duì)抗源基因的依賴(lài)，可以有效地縮短甘蔗抗花葉病育種周期。本發(fā)明已獲得的轉(zhuǎn)基因植株，具有抗性廣譜、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12N15-82, A01H5-00, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104846005
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510093048
【發(fā)明人】郭晉隆, 高世武, 許莉萍, 闕友雄, 蘇亞春, 吳期濱, 林慶良
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月2日