一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的 方法。
【背景技術】
[0002] 在過去的數年里，對NSCLC(非小細胞肺癌）的生物學認知取得進步促使可以識別 出對于惡性腫瘤轉化和癌細胞生存至關重要的一些分子事件并形成了潛在治療靶點。近年 來，關于針對非小細胞肺癌的靶向治療藥物進展迅速，已獲FDA批準的有EGFR小分子抑制 劑吉非替尼，厄洛替尼，ALK小分子抑制劑克唑替尼，色瑞替尼等。值得注意的是，這些靶向 治療藥物都只針對攜帶某些特定基因變異的人群有效。如攜帶EGFRL858R或19號外顯子 缺失性突變的非小細胞肺癌患者對第一代EGFR小分子抑制劑敏感。而攜帶ALK融合的非 小細胞肺癌患者則對ALK小分子抑制劑敏感。因此，隨著祀向治療藥物的推廣，與之配合的 伴隨分子診斷變得必不可少。2015年美國癌癥聯盟（NCCN)指南中建議對非小細胞肺癌患 者檢測七項與靶向藥物相關的基因變異：EGFR突變，ALK融合，MET擴增，ERBB2突變，BRAF 突變，ROS1突變，以及RET突變。
[0003] 早期分子診斷采用多種技術平臺，如定量PCR，FISH，免疫組化等，一次檢測一種 或幾種基因變異，對同一患者采用順位檢測的方法。傳統方法的局限性在于，由于每次檢 測僅限于一種基因，所需的活檢組織量隨檢測基因數的增長而增加。在可預見的未來，將 難以滿足檢測所有靶標基因的需求。與此同時，近期有研宄表明，肺癌中的重要靶點基因 變異并非完全互斥，而是在一小部分患者中并存。Wuetal.的研宄顯示，中國非小細胞 肺癌患者中有1. 3 %同時攜帶EGFR突變與ALK融合（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/24443562)。對于這些患者，對于分子靶點基因變異順序檢測的方法會引起某些基 因變異事件的漏檢，從而使醫(yī)生對該患者最適宜的靶向治療方法產生可能的誤判。而基于 目標區(qū)域捕獲的DNA二代測序法可以一次性平行檢測幾十，乃至上百種基因中包括點突 變，插入缺失，DNA拷貝數改變，融合重排等多種變異形式，從而一次性檢出所有與靶向治療 相關的靶點基因變異，并對于同時并存的基因變異的突變豐度進行估算與排序。因此為突 破傳統分子診斷方法的局限提供了新的途徑。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對現有技術的不足，本發(fā)明旨在提供一種多探針富集56基因靶區(qū)域的方法，通 過設計專用的捕獲探針庫，采用探針捕獲技術一次性富集多個基因多靶點序列，從而實現 多基因多靶點并行深度高通量測序。
[0005] 為了實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0006] 一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的方法，包括如下步驟：
[0007] SIgDNA片段化和加接頭adaptor
[0008] 1. 1)準備所需試劑如下：
[0009]SureSelectQXT終止反應液、SureSelectQXT緩沖液、SureSelectQXT轉座酶溶 液、二甲基亞砜（DMSO)、AMPureXP磁珠、乙醇；
[0010] 1. 2)定量待建庫樣本，調整濃度至25ng/yL，體積2yL;
[0011] 1. 3)PCR儀設置DNA片段化程序，設好程序后，點擊開啟，再立即點擊暫停；
[0012] 1. 4)SureSelectQXT緩沖液和SureSelectQXT轉座酶溶液分別高速渦旋混勻備 用；
[0013] 1. 5)將SureSelectQXT緩沖液、樣本和SureSelectQXT轉座酶溶液依次添加到 PCR管中，于冰上操作配制片段化反應體系，每種試劑單獨添加；配制完成后，短暫離心，再 高速渦旋充分混勻20s，并再次短暫離心，完成后立即將PCR管放置于步驟1. 3)中暫停的 PCR儀上，重新啟動反應程序；
[0014] 1.6)?〇?完成后，立即將其轉移至冰上；然后往其中加32 1^1乂511代5616(^0乂1'終 止反應液，高速渦旋5s，短暫離心，室溫孵育lmin;
[0015] S2AMPureXP磁珠純化
[0016] 2. 1)將AMPureXP磁珠在使用前充分混勻并平衡至室溫；
[0017] 2. 2)將步驟S1中得到的已片段化和加接頭adaptor的樣本轉移至新的1. 5mLEP 管中；
[0018] 2. 3)加入52yL充分混勻的AMPureXP磁珠，渦旋5s，短暫離心，保證磁珠沒有沉 底；
[0019] 2. 4)置于混勻儀上室溫孵育5min ;
[0020] 2. 5)孵育好的樣本短暫離心，放磁力架上吸附磁珠，時間為3-5min，棄上清；
[0021] 2. 6)加300yL現配的70%乙醇，計時lmin，期間沿水平方向緩慢旋轉EP管一圈， 令干擾的磁珠下沉，棄上清；
[0022] 2. 7)重復步驟 2. 6) -次；
[0023] 2.8)短暫離心，將EP管重新放回磁力架靜置30s，使用P10移液器除凈殘留乙醇；
[0024] 2. 9) 37°C烘干磁珠，時間為l_3min，或置于通風廚l-3min使磁珠干燥；干燥完成 后，加36yL不含核酸酶的水，渦旋混勻，短暫離心；
[0025] 2. 10)室溫孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到純化 樣本并放置冰上；
[0026] S3 捕獲前PCR
[0027] 3. 1)所需試劑如下：
[0028] HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5XHerculaseII反應緩沖液、每個三磷酸脫 氧核糖核苷（dNTP)25mM的lOOmMdNTP混合液、SureSelectQXT引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；
[0029] 3. 2)在冰上操作，將5XHerculaseII反應緩沖液、每個dNTP25mM的lOOmMdNTP 混合液、DMSO、SureSelectQXT引物混合物、HerculaseIIFusionDNA聚合酶配制捕獲 前PCR反應混合液，一次反應中各試劑的劑量依次為10yL、0. 5yL、2. 5yL、1yL、1yL和 15yL；
[0030] 3. 3)將步驟3. 2)中制得的捕獲前PCR反應混合液加入35yL步驟S2中得到的純 化樣本中，渦旋5s混勻；然后放置于PCR儀上，設置PCR反應程序并啟動；反應完畢后得到 捕獲前PCR樣本并放置冰上；
[0031] S4AMPureXP磁珠純化
[0032] 4. 1)將XP磁珠在使用前充分混勻并平衡至室溫；
[0033] 4. 2)將步驟S3得到捕獲前PCR樣本轉移至新的1. 5mLEP管中；
[0034] 4. 3)按照步驟2. 3)-2. 10)進行操作；完成后即得到預文庫；
[0035] S5將步驟S4得到預文庫進行質量檢測和濃度檢測，包括預文庫DNA的片段大小是 否主要分布在245-325bp、以及DNA濃度是否滿足彡500ng;
[0036] S6預文庫DNA的準備
[0037] 6. 1)取一定量的通過步驟S5檢測的預文庫至新PCR管中；
[0038] 6. 2)將步驟6. 1)中的樣本PCR管放入濃縮儀中進行濃縮蒸干；
[0039] 6. 3)加入12yL不含核酸酶的水進行溶解，得到12yL預文庫DNA;
[0040] S7 雜交
[0041] 7. 1)準備所需試劑如下：
[0042] SureSelectQXT快速雜交緩沖液、SureSelectQXT快速封閉液、SureSelect RNase封閉劑、捕獲探針庫；
[0043] 需要說明的是，所述捕獲探針庫中的探針主要根據NCCN(美國國立綜合癌癥網 絡）關于非小細胞肺癌（NSCLC)、乳腺癌（breastcancer)、直腸癌（coloncancer)、甲狀 腺癌（thyroidcancer)、腎細胞癌（renalcellcarcinoma)、胃癌（gastriccancer)and 原始神經外胚層腫瘤（PNET)的指導、現已公開的癌癥基因（包括PMID:24071851、PMID: 23945592、PMID:24657537、PMID:24132290、PMID:25656898)、TGGA數據庫所公開的內 容（包括乳頭狀甲狀腺癌：PMID:25417114、腎細胞癌：PMID:25155756,PMID:23792563、 胃癌：PMID:25079317、肺腺癌：PMID:25079552、乳腺癌：PMID:23000897、肺鱗狀細胞癌： PMID:22960745和結腸癌：PMID:22810696)進行選取設計的。
[0044] 7. 2)分兩管配制混合液，記為A管和B管，A管中，用12yL步驟S6得到的預文庫 DNA和5yL的SureSelectQXT快速封閉液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，渦旋 5s混勻，短暫離心；B管中配制捕獲庫雜交混合液，渦旋5s混勻，放置室溫備用；
[0045] 7. 3)PCR儀上設置反應程序，體積設置為30yL;
[0046] 7.4)將A管轉移至PCR儀上，啟動運行，在運行一段時間暫停運行；
[0047] 7. 5)在PCR儀上，將B管中的捕獲庫雜交混合液轉移至A管中，用移液器上下吹打 8-10次，然后密封好，渦旋5s，快速離心后放回PCR儀上繼續(xù)雜交反應程序，反應完畢后得 到雜交樣本；
[0048] S8T1磁珠捕獲
[0049] 8. 1)準備所需試劑如下：
[0050] SureSelect結合緩沖液、SureSelect洗液 2、SureSelect洗液l、DynabeadsMyOne 鏈霉素T1磁珠；
[0051] 8. 2)將DynabeadsMyOne鏈霉素T1磁珠渦旋混勻后，取50yL至新的1. 5mLEP 管中，置于磁力架上靜置幾分鐘，待澄清后棄上清；
[0052] 8. 3)向步驟8. 2)已加入T1磁珠的EP管中加入200yLSureSelect結合緩沖液， 移液器上下吹打10次，放置于磁力架上靜置，待澄清后棄上清；
[0053] 8. 4)重復步驟8. 3)兩次；