一種基于雙功能探針基因芯片檢測方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及屬于基因芯片質(zhì)量控制領(lǐng)域的應(yīng)用方法，具體涉及一種基于雙功能探針基因芯片檢測方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
基因芯片技術(shù)作為近年來快速發(fā)展的一項生物高新技術(shù)，為解決怎樣研究基因在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能提供了光輝的前景?；蛐酒夹g(shù)是指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進(jìn)而獲取樣品序列信息。
[0003]與傳統(tǒng)核酸印跡雜交方法相比，基因芯片同時將大量根據(jù)靶基因的特征及檢測要求預(yù)先設(shè)計好的探針固定在支持物表面，一次雜交可檢測和分析樣品中多種靶基因的相關(guān)信息，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足，使基因芯片技術(shù)具有了高通量、多參數(shù)同步分析，快速全自動分析，高精確度分析，高靈敏度分析的特點。但用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與匹配探針雜交對未知DNA序列片段進(jìn)行檢測的方法本身也存在缺陷:
I)基因芯片熒光檢測主要依賴于檢測結(jié)果的熒光強度，沒有熒光強度或者熒光強度弱的即判斷為陰性，但在陰性的結(jié)果中無法確定是否是探針固定上；2)多種基因芯片技術(shù)平臺得到的研究結(jié)果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成為目前基因技術(shù)研究的熱點，尤其是應(yīng)用型基因芯片尚無一些準(zhǔn)確、高效地有效性檢測方法，其應(yīng)用的推廣尚有困難。因此發(fā)展一種準(zhǔn)確、高效地有效性檢測方案來檢測探針是否固定成為一種迫切的需要。
[0004]基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探針、支持物制備的有效性控制、探針在支持物上的固定效率即基因芯片制備的有效性控制，以及基因芯片檢測時的有效性控制、檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化等一系列問題。本專利主要針對的是制備有效性的基因芯片。
[0005]制備有效性基因芯片的傳統(tǒng)方法有以下幾種:1)利用熒光DNA染料對單鏈DNA探針染色，根據(jù)熒光DNA染料強度來估計芯片的有效性；2)利用目的探針3點樣液和帶熒光I質(zhì)量控制探針8點樣液分別點樣于修飾了手臂分子6的基質(zhì)7上，形成各自的斑點，然后使目的探針3在目斑點處與帶有同種或異種熒光2的待測DNA序列5雜交，根據(jù)質(zhì)量探針8點樣位置是否發(fā)熒光，估計芯片的有效性，根據(jù)目的探針點位置是否發(fā)熒光，判定待測DNA序列信息，如圖1所示。但是以上的這些方法都無法直接、有效地評價芯片制備的質(zhì)量。
[0006]這些傳統(tǒng)基因芯片有效性控制控制的方法可減少了基因檢測中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，在一定程度上提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，但傳統(tǒng)的基因芯片有效性控制檢測，只是把一定濃度的質(zhì)量控制探針固定在目的探針的周圍，質(zhì)量控制探針與目的探針分開點樣于基片上，沒有考慮到目的探針與待測DNA序列的雜交通常位于固相表面，有一定程度的空間阻礙，若目的探針濃度過高，導(dǎo)致目的探針固定不上去，所以通常傳統(tǒng)基因芯片的缺陷是其自身質(zhì)量無法得到較好的控制，本發(fā)明提出了一種基因芯片有效性控制方法，能夠?qū)蛐酒挠行赃M(jìn)行控制，大大提高其檢測的可靠性。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
: 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于雙功能探針基因芯片檢測方法，能較直接地檢測探針是否固定在基片上，以排除因探針缺失而造成的陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，提聞了基因芯片檢測的準(zhǔn)確性和可罪性。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明基于雙功能探針基因芯片檢測方法，包括以下幾個步驟:
步驟一:樣品制備:
制備含有目的探針和寡聚體序列一段序列片段，并且用第一熒光基團標(biāo)記中寡聚體序列的任意堿基，然后將其制備成點樣溶液。
[0009]步驟_.:基因芯片制備
將上述點樣溶液點樣于修飾了手臂分子的基片上形成N個探針斑點，N為自然數(shù)，經(jīng)過固定并清除未固定的探針，完成基因芯片的制備。
[0010]步驟三:檢測目的探針通過手臂分子固定在基片上:
檢測上述所有探針斑點發(fā)出的熒光信號，若在第一熒光基團的激發(fā)波長下檢測到熒光，則表示目的探針通過手臂分子固定在基片上，從而判定基因芯片質(zhì)量合格。
[0011]否則，若任一個探針斑點在第一熒光基團的激發(fā)波長下未檢測到熒光，則表示目的探針未通過手臂分子固定在基片上，判定為基因芯片質(zhì)量不合格。
[0012]本發(fā)明基于雙功能探針基因芯片檢測方法，還包括以下步驟:
步驟四:雜交:
將第二熒光基團標(biāo)記的待測序列與與質(zhì)量合格基因芯片上所述的探針斑點中的目的探針3進(jìn)行雜交，雜交后，目的探針中的探針和待測序列結(jié)合形成雜交產(chǎn)物。
[0013]步驟五:確定待測序列的序列信息:
對所述雜交產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，若在第二熒光基團的激發(fā)波長下檢測到熒光，則確定目的探針與待測序列互補，并確定待測序列的序列信息。
[0014]若在第二熒光基團(2)的激發(fā)波長下未檢測到熒光，則表示不能確定目的探針
(3)與待測序列(5)互補，無法確定待測序列(5)的序列信息。
[0015]所述的手臂分子可在目的探針和寡聚體序列的任意堿基位置。
[0016]所述的目的探針可以是脫氧核糖核酸，核糖核酸或者肽核酸。
[0017]所述的基片可以是玻璃片、硅膠晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微型磁珠或者管蓋。
[0018]所述的第一熒光基團和所述的第二熒光基團可為Cy3、Cy5、Fite, FAM或者Rhodamine，但是所述的第一熒光基團和所述的第二熒光基團使用時不相同，并且在檢測時兩種熒光基團的熒光發(fā)射峰要大于40nm的差異，防止兩者在檢測時由于吸收峰重疊而無法正確得出結(jié)果。
[0019]所述的第一熒光基團(I)和第二熒光基團(2)為生物素-親和素與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物。
[0020]所述的標(biāo)記物質(zhì)為熒光蛋白、鐵蛋白、膠體金、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
[0021]本專利所提的目的探針是一段已知的核酸或核酸類似物序列片斷，并在核酸或核酸類似物鏈上修飾了活性基團，可通過化學(xué)反應(yīng)固定在被修飾手臂分子的基底上；寡聚體序列是一段已知的、較短的核酸或核酸類似物序列片斷；待測序列是一段未知的核酸或核酸類似物序列片斷，末端標(biāo)記了發(fā)光基團或標(biāo)記復(fù)合物；手臂分子是多個碳原子組成兩端均含有活性基團的小分子有機化合物，一端活性基團可與基底發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，另一端活性基團可與修飾了活性基團的核酸或核酸類似物鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
O目的探針與待測DNA序列雜交通常位于固相表面，并且分子大小均為納米級，存在一定的界面效應(yīng)，使得雜交所需離子濃度較少；本發(fā)明若手臂分子與寡聚核苷酸序列末端堿基相連，那么雜交就會相對遠(yuǎn)離固相表面，相應(yīng)的界面效應(yīng)也會減小，使得探針與樣品更容易雜交。若手臂分子與寡聚體序列的第二或第三位堿基相連，則與可為探針與樣品雜交預(yù)留空間，減少空間位阻，同樣有利于目的探針與待測DNA序列雜交。
[0023]2)本發(fā)明將檢測芯片有效性的第一種熒光標(biāo)記直接連接到目的探針，點樣在基片上，通過手臂分子固定于基片上，這樣不僅實時監(jiān)測目的探針是否固定于基片上，也可精確定位出目的探針的位置。
[0024]3)本發(fā)明目的探針與質(zhì)量控制探針相對獨立，目的探針只與待測樣品片段結(jié)合，不與質(zhì)量控制探針形成競爭關(guān)系，目的探針的檢測并不依賴于目的探針與質(zhì)量控制探針雜交的效率，因此探針與樣品片段的結(jié)合效率不會受到影響。
[0025]4)本發(fā)明基因芯片有效性控制方法，若應(yīng)用于基因芯片制備中，則能夠大大提高基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性；同時，不僅可以為基因芯片的制造者提供有效性控制的方法，提高生產(chǎn)質(zhì)量，又可以為基因芯片的使用者在使用之前對芯片做出評價，簡單有效地查出實驗中可能出現(xiàn)的問題，從而減少了實驗中的分析過程，提高了實驗效率。
【附圖說明】
[0026]圖1是現(xiàn)有技術(shù)中的基因芯片有效性控制方法的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明的基于雙功能探針基因芯片檢測方法的整體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明的基于雙功能探針基因芯片檢測方法的第一熒光基團放在目的探針和寡聚體序列之間、手臂分子結(jié)合在目的探針和寡聚體序列末端結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4是本發(fā)明的基于雙功能探針基因芯片檢測方法的第一熒光基團放在目的探針和寡聚體序列末端、手臂分子結(jié)合目的探針和寡聚體序列之間結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖中:1、第一熒光基團，2、第二熒光基團，3、目的探針，4、寡聚體序列序列，5、待測DNA序列，6、手臂分子，7、基片，8、質(zhì)量控制探針。
【具體實施方式】
[0028]下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0029]本發(fā)明的基于雙功能探針基因芯片檢測方法，包括以下幾個步驟:
1、樣品制備:
如圖2、3、4所示，制備含有目的探針3和寡聚體序列4 一段序列片段，并且用第