專(zhuān)利名稱：用于檢測(cè)jak2基因的突變的探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于#r測(cè)與慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative disorder; CMPD ) 一目關(guān)的JAK2基因的突變的
探針及其用途。
背景技術(shù)：
作為在基因水平上分析所有疾病的原因、以及個(gè)體間疾病 易患性(患病的難易程度)、個(gè)體間藥效差異等的方法，點(diǎn)突變， 即單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用。
作為SNP的通常檢測(cè)方法，可舉出(l)擴(kuò)增發(fā)生檢測(cè)目 標(biāo)的突變的區(qū)域，對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行分析的直接 溯寸序(Direct Sequencing )法，(2 )焦石粦酉臾觀寸序(Pyrosequencing ) 法，(3)擴(kuò)增上述區(qū)域，在溫度梯度柱中進(jìn)行HPLC,根據(jù)洗脫 時(shí)間檢測(cè)有無(wú)突變的變性高效液相色譜(Denaturing HPLC )法，
(4)利用熒光探針與含有檢測(cè)目標(biāo)的突變的區(qū)域結(jié)合則發(fā)出熒 光的現(xiàn)象，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)突變的侵入4全測(cè)(Invader) 法，(5)使用將3，末端區(qū)域的任一個(gè)堿基設(shè)計(jì)成與檢測(cè)目標(biāo)的 突變互補(bǔ)的堿基的引物來(lái)進(jìn)行PCR,根據(jù)是否發(fā)生擴(kuò)增來(lái)判斷 突變的ASP ( Allele Specific Primer ) — PCR ( Polymerase Chain Reaction)法(等位基因特異性引物PCR法)等。
但是，上述(1 )、 (2)和(4)方法的靈敏度較低，分別為 約20%、約5%、約5%左右，操作需要很多功夫和時(shí)間。上述
(3 )的方法的靈敏度低達(dá)約10% ,另外，僅能確認(rèn)有無(wú)突變， 而無(wú)法分析在何位點(diǎn)產(chǎn)生了何種突變，具有缺乏特異性的問(wèn)題。 另外，上述(5 )的方法雖然靈敏度高，但特異性低，具有易于產(chǎn)生假陽(yáng)性的問(wèn)題。予以說(shuō)明，靈敏度的數(shù)值(％)越小則靈 敏度越高。
由該問(wèn)題出發(fā)，作為SNP的檢測(cè)方法，近年正在使用如下 所示的Tm ( Melting temperature, 解4連溫度)分才斤。該方法首
先使用與含有4全測(cè)目標(biāo)的SNP的區(qū)域互補(bǔ)的揮:針，以形成待測(cè) 體的核酸與上述探針的雜交體(雙鏈核酸)。然后，對(duì)該雜交體
進(jìn)行加熱處理，通過(guò)測(cè)定吸光度等信號(hào)來(lái)^r測(cè)隨著溫度上升的 雜交體向單鏈的解離(融解)。根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果確定Tm值，從 而判斷SNP的方法。雜交體的同源性越高則Tm值越高，同源性 越低則Tm值越低。因此，例如，首先，預(yù)先求出含有突變型的 SNP的核酸和與其互補(bǔ)的探針的雜交體的Tm值(評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值)。 接著，測(cè)定待測(cè)體的核酸與上述探針的Tm值(測(cè)定值)。然后， 若該測(cè)定值與上述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值相同，則可判斷為完全匹配，即， 待測(cè)體核酸的SNP為突變型。另一方面，若上述測(cè)定值低于上 述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值，則可判斷為錯(cuò)配，即，待測(cè)體核酸的SNP為正 常型。但是，這種使用Tm分析的檢測(cè)方法，普遍存在靈敏度較 低的問(wèn)題。
據(jù)報(bào)道，真性紅細(xì)胞增多癥(Polycythemia vera; PV )、原 發(fā)性血小斧反增多癥(essential thrombocythemia; ET )等慢性骨 髓增殖性疾病(CMPD)中，可高頻率地發(fā)現(xiàn)JAK2基因的突變 型SNP (非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 - 4 )。上述突變型SNP為JAK蛋白質(zhì)的第 617位纈氨酸(V )被替換成苯丙氨酸(F)的突變，JAK2基因 的外顯子12的第73位(成熟mRNA(CDS)的第1849位)的鳥(niǎo) 嘌呤被胸腺嘧啶替代(JAK2 / V617F )。研究認(rèn)為，表達(dá)這種 蛋白質(zhì)的JAK2基因的突變(JAK2/V617F)的檢測(cè)，對(duì)CMPD 的診斷及治療有用。但是，即便是同一位患者的血液樣品，其血液細(xì)胞和含有正常型SNP的正常JAK2基因的血液細(xì)胞。這些 基因的不同，僅僅是SNP的類(lèi)型，即，僅一個(gè)堿基的不同。這 樣，用于一企測(cè)突變型SNP的探針，會(huì)與含有突變型SNP的突變 序列(檢測(cè)對(duì)象序列)因完全匹配而雜交；雖與含有非突變型 SNP的正常型SNP的正常序列(非檢測(cè)對(duì)象序列)有一個(gè)堿基 錯(cuò)配，但也發(fā)生雜交現(xiàn)象。這種情況下，存在如下問(wèn)題在Tm 分析中，做成表示信號(hào)強(qiáng)度與溫度間關(guān)系的融解曲線時(shí)，屬于 完全匹配的突變序列的高溫側(cè)峰會(huì)因?qū)儆阱e(cuò)配的正常序列的低 溫側(cè)峰的存在而難以;險(xiǎn)測(cè)。即，即便存在突變序列時(shí)，其一企測(cè) 也會(huì)由于正常序列的存在而變得困難，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)l: Tefferi A. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006; 240 - 245.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)2: Baxter EJ, Scott LM， Campbell PJ， et al. Lancet. 2005; 365: 1054 - 1061.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3: Kralovics R, Passamonti F, Buser AS ， et al. N Engl J Med. 2005; 352: 1779 - 1790.
非專(zhuān)利文獻(xiàn)4: Levine RL， Wadleigh M, Cools J, et al. Cancer Cell. 2005; 7: 387 - 397.

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)JAK2基因突變 的探針及其用途，所述探針即使在包含僅一個(gè)堿基不同的突變 的突變序列和不含突變的正常序列共存的情況下，也能夠以良 好的靈敏度檢測(cè)到作為檢測(cè)目標(biāo)的所述突變。
為了達(dá)到所述目的，本發(fā)明的探針的特征在于，其為用于 檢測(cè)JAK2基因的突變的探針，由下述(X)和(Y)中的至少 一種寡核苷酸組成，
8(X ):與以序列號(hào)1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子 12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5，方向直至 第17 ~ 22位堿基的區(qū)域序列相同的至少 一 個(gè)寡核苷酸，該寡核 苷酸以上述胞嘧啶堿基(c)作為3，末端，
(Y):由所述(X)的互補(bǔ)序列組成的寡核苷酸。 本發(fā)明的突變的檢測(cè)方法，其特征在于，其為JAK2基因中 的突變的檢測(cè)方法，含有下述工序(A) ~ (C),
(A) 準(zhǔn)備反應(yīng)體系的工序，所述反應(yīng)體系含有要檢測(cè)有 無(wú)所述突變的待測(cè)核酸以及本發(fā)明的探針，
(B) 改變上述反應(yīng)體系的溫度，測(cè)定所述待測(cè)核酸與所 述探針形成的雜交體顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的工序，
(C) 通過(guò)隨溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng)，確定所述待 測(cè)核酸中有無(wú)所述突變的工序。
本發(fā)明的引物對(duì)，其特征在于，其為用于通過(guò)核酸擴(kuò)增法 擴(kuò)增JAK2基因的引物對(duì)，其包括一對(duì)引物，該一對(duì)引物包含由 下述(F)的寡核苷酸所組成的正向引物和由下述(R)的寡核 苷酸所組成的反向引物，
(F):與以序列號(hào)2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區(qū)域序 列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，
(R):與以序列號(hào)2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝3，方向直至第23 47位堿基的區(qū)域互 補(bǔ)的至少 一 個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第255位的胞嘧咬 堿基(C)互補(bǔ)的鳥(niǎo)。票呤堿基(g)作為3，末端。
本發(fā)明的突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其為為了在本發(fā) 明的JAK2基因的突變的檢測(cè)方法中使用的試劑盒，其包含本發(fā)
9明的探針。
根據(jù)本發(fā)明的探針，即使在發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突變JAK2 /
V617F的突變序列(突變基因)與未發(fā)生所述突變的正常序列 (正?；?共存的情況下，也能夠檢測(cè)所述突變序列的有無(wú)， 即能夠4企測(cè)有無(wú)作為一企測(cè)目標(biāo)的突變。如上所述，在前述Tm分 析中，探針通常會(huì)與僅一個(gè)堿基不同的突變序列和正常序列兩 者進(jìn)行雜交。因此，在所述融解曲線中，兩者的信號(hào)重疊，導(dǎo) 致有無(wú)突變序列的檢測(cè)變得非常困難。對(duì)于此問(wèn)題，根據(jù)本發(fā) 明的探針，雖然會(huì)與突變序列和正常序列兩者雜交，但融解曲 線中兩者的信號(hào)能夠充分分離。因此，利用本發(fā)明，能夠以良 好的靈敏度檢測(cè)JAK2基因的突變(JAK2/ V617F)。


圖1為示意本發(fā)明的實(shí)施例1中的T m分析結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，下面將發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突變的JAK2基因稱為 "突變基因或檢測(cè)對(duì)象基因"，將發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突變的序列且 探針能夠雜交的區(qū)域或含有該區(qū)域的序列稱為"突變序列或檢 測(cè)對(duì)象序列"。另外，將未發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突變的JAK2基因稱 為"正?；蚧蚍菣z測(cè)對(duì)象基因"，將未發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突變的 序列且探針能夠雜交的區(qū)域或含有該區(qū)域的序列稱為"正常序 列或非檢測(cè)對(duì)象序列"。另外，將供突變檢測(cè)用的核酸稱為"待 測(cè)核酸或耙核酸"。
其第73位的堿基(k)為檢測(cè)目標(biāo)的堿基。所述第73位的堿基(k) 已知為SNP,例如正常型為g,突變型為t。序列號(hào)2的石威基序列
10為JAK2基因的全長(zhǎng)序列(包括外顯子和內(nèi)含子)中的部分序列， 是包含外顯子12及其周?chē)鷧^(qū)域的序列。例如，JAK2基因的全長(zhǎng) 序歹'j ( 142751bp)的NCBI登錄號(hào)為No. NC一000009。另夕卜，例 如，JAK2基因的mRNA ( 5097bp )的NCBI登錄號(hào)為No. NM—004972,在it登錄的石威基序歹ll中，第2343J立石威基為才企測(cè)3十 象位點(diǎn)。另夕卜，以NCBI登錄號(hào)No. NM—004972登錄的堿基序列 中，第495位~第3893位的區(qū)域?yàn)镃DS序列，CDS中的第1849 位石威基為;f企測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)。 <探針〉
如前所述，本發(fā)明的探針的特征在于，其為用于檢測(cè)JAK2 基因的突變的探針，其為由下述(X)和(Y)中的至少一種寡 核苷酸組成的探針。另外，本發(fā)明的探針亦可為含有上述寡核 苦酸的探針。在本發(fā)明中，上述寡核苷酸(X)只要3，末端滿 足下述條件即可。
(X):與以序列號(hào)1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子 12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5，方向直至 第17 ~ 22位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核 苷酸以上述胞嘧啶石威基(c)作為3，末端
(Y):由所述(X)的互補(bǔ)序列組成的寡核苷酸
本發(fā)明的探針，其為用于檢測(cè)序列號(hào)1中所示的JAK2基因 外顯子12的第73位(k)、即JAK2基因的cDNA(對(duì)應(yīng)成熟mRNA) 的第1849位堿基(k)的突變(g—t)的探針。本發(fā)明的探針中， 由上述寡核苷酸(X)組成的探針，與JAK2基因的反義鏈 (opposite strand )互補(bǔ)，能夠確認(rèn)反義鏈中的突變。另夕卜，本 發(fā)明的探針中，由上述寡核苷酸(Y)組成的探針，與JAK2基 因的有義鏈(正鏈)互補(bǔ)，能夠確認(rèn)有義鏈中的突變。
本發(fā)明的探針，可設(shè)計(jì)為例如與JAK2基因的第73位突變后常(g)的 正常序列完全匹配。
在本發(fā)明的探針中，作為所述寡核苷酸(X)，例如，可舉 出序列號(hào)3 ~ 8中所示的寡核苷酸。在下述序列中，k可以是g和t 中的任意一個(gè)，設(shè)計(jì)為與突變序列完全匹配時(shí)，優(yōu)選"t";設(shè)計(jì) 為與正常序列完全匹配時(shí)，優(yōu)選"g"。這些序列中，優(yōu)選由序列 號(hào)5所示的寡核苷酸組成的探針，更優(yōu)選由序列號(hào)5中堿基k為胸 腺嘧啶的寡核苷酸組成的探針。
5， - tatgtktctgtggagac - 3，(序歹'J號(hào)3 )
5 ， - gtatgtktctgtggagac - 3 ，(序歹'J號(hào)4 )
5， - agtatgtktctgtggagac - 3，(序歹ll號(hào)5 )
5， 一 gagtatgtktctgtggagac — 3，(序歹寸號(hào)6 )
5, - ggagtatgt^tctgtggagac - 3,(序歹'J號(hào)7 )
5， _ tggagtatgt^tctgtggagac — 3，(序歹寸號(hào)8 )
這些寡核苷酸為分別與序列號(hào)l的堿基序列中從第62、 63、 64、 65、 66或67位到第84位的區(qū)域(第73位是g或t)的互補(bǔ)序 列結(jié)合的序列。
本發(fā)明的纟笨針優(yōu)選用標(biāo)記物標(biāo)記的纟罙針。所述標(biāo)記物并無(wú) 限定，可舉出熒光染料(熒光團(tuán))。作為所述標(biāo)記探針的具體例 子，例如優(yōu)選用所述熒光染料標(biāo)記、單獨(dú)時(shí)顯示熒光且通過(guò)雜 交而熒光強(qiáng)度減弱(例如猝滅)的探針。這種現(xiàn)象一般稱為熒 光猝滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon )。作為利用這種熒光猝滅 現(xiàn)象的探針，優(yōu)選其中一般稱為鳥(niǎo)嘌呤猝滅探針的探針。這種 探針已知有所謂的QProbe (注冊(cè)商標(biāo))。鳥(niǎo)。票呤猝滅探針是指， 例如將寡核苷酸的3 ，末端或5，末端的堿基設(shè)計(jì)為胞嘧啶，使用 一種當(dāng)該末端的石威基胞嘧啶接近與其互補(bǔ)的i咸基鳥(niǎo)噤呤時(shí)發(fā)光 就會(huì)減弱的熒光染料標(biāo)記前述末端的探針。在本發(fā)明的探針中，例如可使顯現(xiàn)焚光猝滅現(xiàn)象的熒光染料與前述寡核苷酸的3，末 端的胞嘧咬結(jié)合，亦可將上述寡核苷酸的5，末端^L計(jì)為胞嘧啶， 并使其與顯現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象的熒光染料結(jié)合。
上述熒光染料并無(wú)限定，例如可舉出熒光素、磷光體、羅
丹明、聚甲炔染料衍生物等、市售的熒光染料可舉出例如 BODIPYFL (商標(biāo)名，Molecular Probes7>司生產(chǎn))、FluorePrime
(商品名，Amersham Pharmacia公司生產(chǎn))、Fluoredite (商品 名，Millipore公司生產(chǎn))、FAM ( ABI公司生產(chǎn))、Cy3和Cy5
(Amersham Pharmacia公司生產(chǎn))、TAMRA ( Molecular Probes 公司生產(chǎn))等。探針的檢測(cè)條件并無(wú)特別限定，可根據(jù)使用的 焚光染^牛適當(dāng)決定，例如太平洋藍(lán)(Pacific Blue )可在才企測(cè)波 長(zhǎng)450 ~ 480nm下才企觀'j , TAMRA可在沖企須'J S皮長(zhǎng)585 ~ 700nm下斗全 測(cè)，BODIPYFL可在檢測(cè)波長(zhǎng)515 ~ 555nm下檢測(cè)。若使用此類(lèi) 探針，能根據(jù)信號(hào)的變動(dòng)容易地確定雜交與解離。
本發(fā)明的探針，例如可在3，末端上附加磷酸基團(tuán)。如后文 所述，可以通過(guò)PCR等核酸擴(kuò)增方法制備用來(lái)檢測(cè)有無(wú)突變的 待測(cè)核酸(耙核酸)，此時(shí)可使本發(fā)明的探針與核酸擴(kuò)增反應(yīng)的 反應(yīng)體系共存。這種情況下，若探針的3，末端預(yù)先附加有磷酸 基團(tuán)，則能夠充分防止探針自身通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而延伸。此 外，亦可以在3，末端附加上述標(biāo)記物來(lái)獲得同樣的效果。
如前所述，本發(fā)明的^:針，可用于檢測(cè)JAK2基因的突變。 該突變的檢測(cè)方法無(wú)任何限定，只要是利用待測(cè)核酸與所述探 針雜交的方法即可。作為應(yīng)用本發(fā)明探針的方法的 一 個(gè)例子， 以下對(duì)利用Tm分析進(jìn)行的突變檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明。 <突變4企測(cè)方法>
如前所述，本發(fā)明的突變^r測(cè)方法的特4正在于，其為^f全測(cè) JAK2基因中的突變的方法，包含下述工序(A) ~ (C)。
13(A)準(zhǔn)備反應(yīng)體系的工序，所述反應(yīng)體系含有要檢測(cè)有 無(wú)所述突變的待測(cè)核酸與本發(fā)明的探針
(B )改變上述反應(yīng)體系的溫度，測(cè)定所述《爭(zhēng)測(cè)核酸與所
述探針形成的雜交體顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的工序
(c)通過(guò)隨溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng)，確定所述待
測(cè)核酸中有無(wú)所述突變的工序
根據(jù)本發(fā)明的突變檢測(cè)方法，可檢測(cè)序列號(hào)1所示的JAK2 基因的外顯子12中第73位的堿基(k)的突變(g—1)。根據(jù)本 發(fā)明的突變一全測(cè)方法，例如能夠以比目前的直接測(cè)序法以及焦 磷酸測(cè)序法更優(yōu)異的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明中的待測(cè)核酸，例如可以是單鏈，也可以是雙鏈。 雙鏈的情況下，例如為使待測(cè)核酸和l笨針雜交以形成雜交體， 優(yōu)選包括通過(guò)加熱將所述雙鏈解離為單鏈的工序。
所述待測(cè)核酸的種類(lèi)并無(wú)特別限定，例如，可舉出DNA以 及總RNA、 mRNA等RNA等。另夕卜，所述待測(cè)核酸例如可列舉 生物樣品等樣品中包含的核酸。所述樣品中的核酸，例如可以 是生物樣品中本來(lái)所包含的核酸，但從能提高突變檢測(cè)精度的 角度出發(fā)，例如可列舉以上述生物樣品中的核酸作為模板， 利用核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物等。作為具體例子，例如 可列舉以上述生物樣品中本來(lái)所包含的DNA為才莫板，通過(guò)核 酸擴(kuò)增法擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物；以及由上述生物樣品中本來(lái)所 包含的RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT-PCR: Reverse Transcription PCR)生成cDNA，將該cDNA作為模板利用核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增得
上述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度并無(wú)特別限定，例如可為50~ 1000堿基， 優(yōu)選為80~ 200堿基。
所述生物樣品并無(wú)特別限定，例如，可列舉白細(xì)胞等血細(xì)胞樣品，全血樣品等。另外，本發(fā)明中，對(duì)取樣方法、DNA及 RNA等核酸的制備方法等并無(wú)限定，可采用以往公知的方法。
在待測(cè)核酸為上述那樣利用核酸擴(kuò)增法由模板核酸擴(kuò)增得 到的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，上述(A)工序還可包含使用引物由模板核 酸擴(kuò)增4寺測(cè)核酸的工序。
所述引物并無(wú)特別限定，只要能擴(kuò)增JAK2基因中本發(fā)明的 探針能夠雜交的區(qū)域即可。所述擴(kuò)增區(qū)域，例如既可僅限于所 述探針?biāo)s交的區(qū)域，亦可為包含上述雜交區(qū)域的區(qū)域。作為 引物，例如可以為正向引物和反向引物中的^f壬意一種，優(yōu)選以 兩者作為一對(duì)同時(shí)使用。作為引物，可使用后文所述的引物， 但并不限于此。
本發(fā)明中，本發(fā)明的探針的添加比例并無(wú)限定，由于能夠 充分確保檢測(cè)信號(hào)，本發(fā)明的探針相對(duì)于待測(cè)核酸的摩爾比優(yōu) 選為l倍以下，更優(yōu)選為0.1倍以下。此時(shí)，待測(cè)核酸既可以指 例如發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變的突變序列(檢測(cè)對(duì)象序列)與未發(fā)生 所述突變的正常序列(非檢測(cè)對(duì)象序列)的總和，亦可指含有 所述突變序列的擴(kuò)增產(chǎn)物與含有所述正常序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的總 和。另外，雖然通常含有待測(cè)核酸的樣品中突變序列的比例不 詳，但從結(jié)果來(lái)看，所述探針的添加比例(摩爾比)優(yōu)選相對(duì) 于突變序列或包含其的擴(kuò)增產(chǎn)物為10倍以下，更優(yōu)選為5倍以 下，進(jìn)一步優(yōu)選為3倍以下。另外，其下限并無(wú)特別限定，例如 為0.001倍以上，優(yōu)選為0.01倍以上，更優(yōu)選為0.1倍以上。
本發(fā)明的探針相對(duì)于所述待測(cè)核酸的添加比例，例如可以 為相對(duì)于雙鏈核酸的摩爾比，亦可以為相對(duì)于單鏈核酸的摩爾比。
對(duì)Tm值進(jìn)行說(shuō)明。例如，當(dāng)持續(xù)對(duì)含有雙鏈DNA的溶液進(jìn) 行加熱時(shí)，260nm處的吸光度將上升。這是因?yàn)椋p鏈DNA中兩條鏈之間的氫4建因加熱而打開(kāi)，解離成單鏈DNA ( DNA的融 解)。而且，當(dāng)全部雙鏈DNA解離為單鏈DNA時(shí)，其吸光度顯 示為加熱開(kāi)始時(shí)的吸光度(僅雙鏈DNA時(shí)的吸光度)的約1.5 倍左右，由此可以判斷融解結(jié)束。根據(jù)該現(xiàn)象，融解溫度Tm— 般定義為吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時(shí)的溫度。
在本發(fā)明中，用于確定Tm值的、伴隨溫度變化的信號(hào)變動(dòng) 的測(cè)定，可基于上述原理，通過(guò)測(cè)定260nm處的吸光度而進(jìn)行， 但優(yōu)選測(cè)定附加在本發(fā)明的探針上的標(biāo)記的信號(hào)。因此，本發(fā) 明的探針優(yōu)選使用前述標(biāo)記探針。所述標(biāo)記探針，例如可列舉 單獨(dú)顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或者單獨(dú) 不顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。如為前者的探 針，則在與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈)時(shí)不顯示信號(hào)， 而在探針因加熱而游離時(shí)顯示信號(hào)。另外，如為后者的探針， 則在與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈)時(shí)顯示信號(hào)，并在探 針因加熱而游離時(shí)信號(hào)減少(消失)。因此，通過(guò)在信號(hào)特有的 條件(吸光度等)下4全測(cè)該標(biāo)記所產(chǎn)生的信號(hào)，可如上述260nm 處的吸光度測(cè)定一樣，實(shí)施融解的進(jìn)行及確定Tm值。標(biāo)記探針 中的標(biāo)記物，例如如前所述。
其次，將以使用用熒光染料標(biāo)記的標(biāo)記探針作為本發(fā)明的 探針為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的突變檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明的突 變檢測(cè)方法的特征在于，其使用本發(fā)明的探針，對(duì)于其他工序 及條件并無(wú)任何限定。
首先，從全血中分離基因組DNA。全血中基因組DNA的分 離可根據(jù)以往7>知的方法進(jìn)行，例如可使用市售的基因組DNA 分離試劑盒(商品名稱GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE Healthcare Bio-Sciences公司生產(chǎn))等。
其次，向包含分離出的基因組DNA的才羊品中添加標(biāo)記牙笨針。所述標(biāo)記探針例如優(yōu)選為QProbe。該QProbe — 4殳為#笨針末 端的胞嘧口定堿基被熒光染料標(biāo)記的探針，通過(guò)其與檢測(cè)對(duì)象序 列雜交，所述熒光染料與檢測(cè)對(duì)象序列的鳥(niǎo)嘌呤堿基相互作用， 其結(jié)果使熒光減少(或猝滅)。
所述纟果4j"的添加時(shí)才幾并無(wú)特別限定，例如既可以在下述擴(kuò) 增反應(yīng)之前，也可以在擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中以及擴(kuò)增反應(yīng)之后任 意時(shí)機(jī)添加到擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中即可。其中，為使擴(kuò)增反 應(yīng)與上述(B)工序能夠連續(xù)進(jìn)行，優(yōu)選在擴(kuò)增反應(yīng)之前添加。 這樣在核酸擴(kuò)增反應(yīng)之前添加所述纟果4十時(shí)，例如如前所述，優(yōu) 選在其3，末端上附加熒光染料或附加磷酸基團(tuán)。
所述探針可以添加到含有分離出的基因組DNA的液體樣 品中，亦可以在溶劑中與基因組DNA混合。所述溶劑并無(wú)特別 限定，例如，可列舉Tris - HC1等緩沖液、含有KC1、 MgCl2、 MgS04、甘油等的溶劑、PCR反應(yīng)液等以往公知的溶劑。
接著，以分離出的基因組DNA為模板，利用PCR等核酸擴(kuò) 增法，擴(kuò)增包含檢測(cè)目標(biāo)的堿基位點(diǎn)的序列。所述核酸擴(kuò)增法 并無(wú)限定，例^(口， 可歹寸舉PCR ( Polymerase Chain Reaction, 聚 合酶鏈反應(yīng))法、NASBA ( Nucleic acid sequence based amplification , 基于核酸序歹'J的擴(kuò)增)法、TMA (Transcription-mediated amplification, 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)法、 SDA ( Strand Displacement Amplification,鏈置換擴(kuò)增)法等， 但優(yōu)選PCR法。另外，以下將以PCR法為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明， 但并非局限于此。另外，PCR的條件并無(wú)特別限定，可根據(jù)以 往/>知的方法進(jìn)4亍。
PCR引物的序列只要能擴(kuò)增含有檢測(cè)目標(biāo)的堿基位點(diǎn)的序 列即可，并無(wú)特別限定，如前所述可根據(jù)目的序列，基于以往 公知的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)。引物的長(zhǎng)度并無(wú)特別限定，可設(shè)計(jì)為一l殳長(zhǎng)度(例如IO ~ 30mer )。
本發(fā)明的4全測(cè)方法中使用的引物對(duì)，例如可列舉后述的本 發(fā)明的引物對(duì)。另外，本發(fā)明的引物對(duì)的用途并不局限于本發(fā) 明的檢測(cè)方法，還有本發(fā)明的檢測(cè)方法中使用的引物對(duì)也并不 局限于本發(fā)明的引物對(duì)。
其次，進(jìn)行所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解離、及通過(guò)解離得到的 單鏈DNA與所述標(biāo)記探針的雜交。該步驟例如可通過(guò)改變上述 反應(yīng)液的溫度來(lái)進(jìn)行。
所述解離工序中的加熱溫度，只要可以使所述擴(kuò)增產(chǎn)物解 離即可，并無(wú)特別限定，例如為85 95。C。對(duì)加熱時(shí)間也并無(wú) 特別限定，通常為1秒 10分鐘，優(yōu)選1秒 5分鐘。
另外，解離的單鏈DNA與所述標(biāo)記探針的雜交，例如可在 上述解離工序之后，通過(guò)降低上述解離工序中的加熱溫度來(lái)進(jìn) 行。溫度條件為例如40 50°C。
雜交工序的反應(yīng)體系(反應(yīng)體系)中的各組成的體積及濃 度并無(wú)特別限定。作為具體例子，所述反應(yīng)體系中的DNA濃度， 例如為O.Ol ~ ljimol/L，優(yōu)選為O.l ~ 0.5|imol/L，所述標(biāo)記4罙4十 的濃度，優(yōu)選例如可滿足對(duì)所述DNA的添加比例的范圍，例如
o.ooi ~ io,oi/l,優(yōu)選為o.ooi ~ i拜o1/:l。
然后，改變上述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物和上述 標(biāo)記探針形成的雜交體顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值。具體而言，例
如將上述反應(yīng)液(上述單4連DNA與上述標(biāo)記纟笨針形成的雜交 體)加熱，并測(cè)定隨著溫度上升的信號(hào)值的變動(dòng)。如前所述， 當(dāng)使用末端的C堿基被標(biāo)記的探針(鳥(niǎo)噤呤猝滅探針)時(shí)，在 與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下熒光減少(或猝滅)，在解離的狀態(tài) 下發(fā)出熒光。因此，例如只需緩慢加熱熒光已減少(或猝滅) 的雜交體，測(cè)定隨溫度上升而增加的熒光強(qiáng)度即可。測(cè)定熒光強(qiáng)度的變動(dòng)時(shí)的溫度范圍并無(wú)特別限定，例如起
始溫度為室溫~ 85°C ，優(yōu)選為25 ~ 70°C ，終止溫度為40 ~ 105°C。 另外，對(duì)溫度的上升速度并無(wú)特別限定，例如為O.l ~ 20。C/秒， 優(yōu)選為0.3 ~ 5。C/秒。
其次，分4斤所述4言號(hào)的變動(dòng)，以確定TnHi。具體而言，由 得到的熒光強(qiáng)度，來(lái)計(jì)算例如各溫度下每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度 變化量。變化量為(-d熒光強(qiáng)度增加量/dt)時(shí)，例如可將顯示 最低值的溫度確定為T(mén)m值。另外，變化量為(d熒光強(qiáng)度增加 量/dt)時(shí)，例如可將最高點(diǎn)確定為T(mén)m值。另夕卜，在使用的標(biāo)記 探針不是猝滅探針，而是單獨(dú)不顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而顯示信 號(hào)的探針的情況下，則恰好相反，只需測(cè)定熒光強(qiáng)度的減少量 即可。
所述Tm值，例如既可以通過(guò)以往公知的MELTCALC軟件 (http:〃www.meltcalc.com/ ) 等計(jì)算，也可通過(guò)最近鄰法 (Nearest Neighbor Method )確定。
然后，由這些Tm值確定目標(biāo)堿基位點(diǎn)的基因型(突變型、 正常型等)。Tm分析中，能夠獲得如下的結(jié)果完全互補(bǔ)的雜 交體(完全匹配)與一個(gè)堿基不同的雜交體(錯(cuò)配)相比，其 顯示解離的Tm值將變高。因此，通過(guò)對(duì)上述探針預(yù)先確定完全 互補(bǔ)的雜交體的Tm值和 一 個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值，可確 定目標(biāo)堿基位點(diǎn)的基因型。例如，假設(shè)目標(biāo)堿基位點(diǎn)的堿基為 突變型，則在使用的探針與包含該突變型堿基的檢測(cè)目標(biāo)序列 互補(bǔ)的情況下，如果形成的雜交體的Tm值與完全互補(bǔ)的雜交體 的Tm值相同，則可將目標(biāo)堿基判斷為突變型。另外，如果形成 的雜交體的Tm值與一個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值相同(比完 全互補(bǔ)的雜交體的Tm值更低的值)，則可將目標(biāo)堿基判斷為正 常型。
19另夕卜，如前所述，在本發(fā)明中，例如，也可以進(jìn)行雜交體 形成時(shí)的信號(hào)變動(dòng)的測(cè)定，來(lái)代替升高包含所述探針的反應(yīng)液 的溫度(加熱雜交體)后，測(cè)定伴隨溫度上升的信號(hào)變動(dòng)的方 法。即，也可以在降低包含所述探針的反應(yīng)液的溫度以形成雜 交體時(shí)，測(cè)定伴隨所述溫度下降的信號(hào)變動(dòng)。
作為具體例子，在使用單獨(dú)時(shí)顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而不顯
示信號(hào)的標(biāo)記探針(例如，鳥(niǎo)嘌呤猝滅探針)的情況下，當(dāng)處
于單鏈DNA與探針解離狀態(tài)時(shí)發(fā)出熒光，然而在通過(guò)降低溫度
而形成雜交體時(shí)，所述熒光則減少(或猝滅)。因此，例如只需 通過(guò)緩慢降低上述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定隨著溫度下降而減少的 熒光強(qiáng)度即可。另一方面，在使用單獨(dú)時(shí)不顯示信號(hào)且通過(guò)雜
交而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針的情況下，當(dāng)處于單鏈DNA與探針解 離狀態(tài)時(shí)不發(fā)出熒光，然而在通過(guò)降低溫度而形成雜交體時(shí)， 則發(fā)出熒光。因此，例如只需通過(guò)緩慢降低上述反應(yīng)液的溫度， 測(cè)定隨著溫度下降而增加的熒光強(qiáng)度即可。 <引物對(duì)〉
本發(fā)明的引物對(duì)，其特征在于，其為用于通過(guò)核酸擴(kuò)增法 擴(kuò)增JAK2基因的引物對(duì)，其包括一對(duì)引物，該一對(duì)引物包含由 下述(F)的寡核苷酸組成的正向引物及由下述(R)的寡核苷 酸組成的反向引物。
(F ):與以序列號(hào)2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基(c ) 作為第一位》威基并朝5，方向直至第24 ~ 44位石成基的區(qū)域序列相 同的至少一個(gè)寡核香酸，該寡核苷酸以所述胞嘧咬堿基(c)作 為3，末端
(R):與以序列號(hào)2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區(qū)域互 補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第255位的胞嘧啶
20堿基(C)互補(bǔ)的鳥(niǎo)噤呤堿基(g)作為3，末端
在本發(fā)明中，只要各引物中起著決定DNA聚合酶的擴(kuò)增起 始點(diǎn)作用的3，末端堿基滿足上述條件即可。
這樣，由于只需將正向引物和反向引物的3，末端的堿基固 定即可，各引物的長(zhǎng)度本身并無(wú)特別限定，可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整為 一般長(zhǎng)度。作為引物長(zhǎng)度的一例，例如在13 ~ 50mer的范圍內(nèi)， 優(yōu)選14 45mer,更優(yōu)選15 40mer。作為具體例子，上述正向 引物優(yōu)選為與以序列號(hào)2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基(優(yōu)選第 25~35位石威基，更優(yōu)選第27 ~ 32位石威基)的區(qū)域序列相同的至 少一個(gè)寡核普酸。另外，上述反向引物優(yōu)選為與以序列號(hào)2 的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝3， 方向直至第23 ~ 47位堿基(優(yōu)選第25 ~ 38位堿基，更優(yōu)選26~ 31位堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少一個(gè)寡核苷酸。另外，由于正向 引物與反向引物的3，末端被固定，由引物延伸出的區(qū)域?yàn)槔?如序列號(hào)2中的第194位~第254位的區(qū)域，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的總 長(zhǎng)根據(jù)所使用的引物長(zhǎng)度而變化。
而且，反向引物可以是與序列號(hào)2所示的堿基序列不完全互 補(bǔ)的寡核苷酸，正向引物也可以是與上述堿基序列的互補(bǔ)鏈的 堿基序列不完全互補(bǔ)的寡核普酸。即，各引物中除3，末端的堿 基以外的部分，例如可以與完全互補(bǔ)的寡核苷酸有l(wèi)個(gè)~ 5個(gè)堿 基不同。
但本發(fā)明不限于此。其中，正向引物優(yōu)選序列號(hào)25,反向引物 優(yōu)選序列號(hào)51。 [表l ]( 正向引物) 序列號(hào)
5 ， -1tagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'9
5， -tagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3，10
5， -agtctttctttg3agcagca8gtatgatgagcaagctttctc-3'11
5' -gtctttctttg8agc鄉(xiāng)38gt8tgatgagcaagctttctc-3'12
5' -tctttctttgaagc3gc朋gtatgatgagcaagctttctc-3'3
5， -ctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'14
5' -tttctttgaagc鄉(xiāng)aagtatgatgagcaagctttctc-3'15
5 ， -ttctttgasgcagcaagtatgatgagcaagctttcte—3'16
5' -tctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'17
5 ， -ctttgaagc鄉(xiāng)鄉(xiāng)t8tgatgagcaagctttctc-3，18
5， -tttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3，19
5' -ttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'20
5' -tgaagc8gca灘tatgatgagcaagc tttctc-3'21
5' -gaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3 ，22
5 ， -aagcagcaagtatgatgagcaagc tttctc-3'23
5 ， -agcagc卿tatgatg鄉(xiāng)aagctttctc-3 ，24
5 ， -gcsgcasgtatgatgagcaagctttctc-3 ，25
5 ， -C8gcaagtatgatgagca3gctttctc-3，26
^ -agcaagtatgatgagcaagctttctc-3，27
5， -gcaetgtatgatgagc卿ctttctc-3，28
5, -caagtatgatgagcaagctttctc-3，29
5， —aagtatgat跳caagctttctc—3,30(反向引物〉 序列號(hào)
5 ， —ctatataa3ca88Ji8cagatgctctgaga朋ggC3ttagaaagcctg"3 ，31
5 > -tatataa8ca朋aacagatgctctg8gaaaggcatt3gaaagcctg"3 ，32
5， —atataaaca3aaa.c3gatgctctg3gaaaggcattaga33gcctg~3，33
5' -tataaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3，34
5' -ataaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg~3，35
5' —taaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3，36
5' -a3ac3a3aacagatgctctg3gaaaggcattagaaagcctg—3，37
5 ， 一aacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，38
5, -ac幼a88eagatgctctg8gaaaggcattaga冊(cè)gcctg-3,39
5' —casaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，40
5 ， 一a3aaac8g3tgctctgaga8aggcatt8gaEiagcctg—3 ，41
5 ， —aaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg"3'42
5 ， -asacagatgctctgagaaaggcatt8gaaagcctg~3}43
5 ， —aacagatgctctgaga83ggcattegaaagcctg"3 ，44
5， 一acagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-"3 ，45
5 ， —cagatgctctgagaa8ggcatt觀aaagcctg-3'46
5， ~agatgGtctgagaaaggcattagaaagcctg~3 ，47
5 ， 一gatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3'48
5' -atgctctg3gaaaggcattaga犯gcctg~3'49
5 ， —tgetctgagaaaggeattagaaagcctg—3 ，50
5， —gctctgagaaaggcattaga幼gcctg-3,51
5 ， —ctctgagaaaggcattagaaagcctg~3 ，52
5' -tctgag3aaggcattagaaagcctg~3 ，53
5' —ctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，54
5， —tgaga朋ggc8ttag朋agcctg"3，55
本發(fā)明的引物對(duì)中的正向引物與反向引物的摩爾比并無(wú)特 別限定。而且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中的上述兩者的摩爾比也并
無(wú)特別限定，例如，正向引物(F)與反向引物(R)的摩爾比 (F: R)優(yōu)選為1:0.01 ~ 100,更優(yōu)選為1:0.1 ~ 10,特別優(yōu)選為 1:0.5 ~ 2。<突變一企測(cè)試劑盒〉
本發(fā)明的突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其為為了在本發(fā)
明的JAK2基因中的突變的檢測(cè)方法中使用的突變檢測(cè)試劑盒，
其包含本發(fā)明的探針。本發(fā)明的特征在于，使用上述本發(fā)明的 探針，對(duì)其它組成等并無(wú)任何限定。而且，本發(fā)明的使用方法，
可按照本發(fā)明的突變^r測(cè)方法進(jìn)行。
本發(fā)明的突變檢測(cè)試劑盒，還可進(jìn)一步包括構(gòu)成本發(fā)明的 引物對(duì)的正向引物和反向引物中的任意一種，也可同時(shí)包括兩 者。而且，本發(fā)明的突變纟全測(cè)試劑盒，例如還可進(jìn)一步包括核 酸擴(kuò)增所需的試劑、使用說(shuō)明書(shū)等。
下面，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不局 限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
JAK2基因外顯子12的第73位堿基的點(diǎn)突變(g—t)的檢測(cè) 使用本發(fā)明的探針，對(duì)序列號(hào)1所示的JAK2基因的外顯子 12的第79位石威基的點(diǎn)突變(g—t)進(jìn)行Tm分析。 (受試品)
使用JAK2 / V617F陽(yáng)性白血病細(xì)胞抹HEL和JAK2野生型 白血病細(xì)胞抹MYL。將各細(xì)胞的培養(yǎng)液混合，使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到 以下比例，并將10[iL該培養(yǎng)混合液在95。C下處理5分鐘，將處 理后的樣品作為PCR用樣品。 [表3 ]HEL: MYL
(mt脆)銜生型DNA)
0: 10 0
0個(gè): 1 X 1 06個(gè)
1: 9 9
1 X 1 o4個(gè):9 9 X104個(gè)
1 0: 9 0
1 X 1 0 5個(gè): 9 X 1 0 5個(gè)
10 0: 0
1 X 1 0 6個(gè) 0個(gè)
(探針和引物對(duì))
檢測(cè)用探針(序列號(hào)3) 5， - agtatgtTtctgtggagac - ( TAMRA ) _ 3, 正向引物(序列號(hào)25) 5" - gcagcaagtatgatgagcaagctttctc - 3' 反向引物(序列號(hào)51 ) 5' - gctctgagaaaggcattagaaagcctg - 3， (Tm分析)
在5pL上述PCR用樣品中加入由20^L下述P -mix和25|aL下 述E-mix形成的混合液，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)如下使 用熱循環(huán)儀，95。C處理60秒后，以95。C處理5秒和58。C處理30 秒為一循環(huán)，重復(fù)35 50個(gè)循環(huán)，隨后95。C處理1秒，40。C處理 60秒。此后繼續(xù)以rC/3秒的溫度上升速度，將所述PCR反應(yīng)液 從40。C加熱至70°C ,測(cè)定經(jīng)時(shí)的熒光強(qiáng)度的變化(波長(zhǎng)585 ~ 700腿)。
25[表4]
(P-m i x) 蒸餾水
100Mmol/L正向引物 100/xmol/L反向引物 5"m。l/L檢測(cè)用探針
(E-m i x) 18.75 蒸餾水 8.5
0.25 2.5廳1/L dNTP 4 '
0.5 10X Gene Taq buffer* 5
_0.5 40%甘油 6.25
總計(jì) 20 mL 20% bsa 1
5U/u1 GeneTaa FP* 0. 25 總計(jì) 25 m L
* 商品名GeneTaqFP (二'7求y^—V.公司制)
該結(jié)果如圖l所示。圖l為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變化
的Tm分析圖。該圖中，(W)表示野生型(正常型)DNA( 100%) 的結(jié)果；(M)表示mt (突變型)DNA ( 100%)的結(jié)果；(Ml ) 表示mtDNA:野生型DNA為l:99的混合物的結(jié)果；(M10 )表示 mtDNA:野生型DNA為10:90的混合物的結(jié)果。如該圖(W)所 示，野生型DNA( 100%)的峰^f直為52。C,如(M)所示，mtDNA (100%)的峰值為58。C。以這些峰值溫度(Tm值)作為評(píng)價(jià) 標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)野生型DNA與mtDNA的混合物的峰進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其結(jié) 果，如該圖中的(Ml)與(M10)所示，使用上述檢測(cè)用探針 的結(jié)果，分別在與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的溫度下，檢測(cè)到野生型 DNA的峰和mtDNA的峰。由此結(jié)果可知，通過(guò)本發(fā)明的探針， 即使在mtDNA和野生型DNA共存的情況下，也可以充分確保 mtDNA的檢測(cè)靈敏度。而且，可知在采用一^:的直接測(cè)序法和 焦磷酸測(cè)序法的情況下，檢測(cè)靈敏度約為5 20%，即，若不存 在5 ~ 20%的mtDNA則難以檢測(cè)到，但通過(guò)使用所述檢測(cè)用探針 進(jìn)行Tm分析，即便mtDNA僅約為1%也能夠充分地檢測(cè)，可知 其靈敏度極高。
另外，采集慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者的血液，進(jìn)行基因組DNA的提取，采取同樣的方法，對(duì)JAK2基因的突變 進(jìn)行Tm分析。其結(jié)果，在眾多患者中，所有真性紅細(xì)胞增多癥 病例(PV病例10例)和原發(fā)性血小^反增多癥病例(ET病例 4例)中均檢出JAK2-V617F。另夕卜，對(duì)于ET病例，其位于直接 測(cè)序法的4企測(cè)限以下，所以可知本實(shí)施例中的方法具有才及高的 檢測(cè)靈敏度，特別有用。 工業(yè)上的可利用性
如上所述，通過(guò)本發(fā)明的探針，即使在發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變 的JAK2基因(突變基因)與未發(fā)生突變的JAK2基因(正?；?因)共存的情況下，也能夠檢測(cè)出含有檢測(cè)目標(biāo)突變的突變基 因。例如，在所述Tm分析中，若為以往的探針，如上所述，因 探針會(huì)與僅一個(gè)堿基不同的突變基因以及正?；騼烧唠s交， 因此所述融解曲線中兩者的信號(hào)重疊，而非常難以檢測(cè)出突變 基因的存在。相對(duì)于此，利用本發(fā)明的探針，雖然探針會(huì)與突 變基因以及正?；騼烧唠s交，但在融解曲線中可以分離兩者 的信號(hào)。而且，通過(guò)使用本發(fā)明的探針的方法，具有比已知方 法直接測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法更高的檢測(cè)靈敏度。因此，根據(jù) 本發(fā)明，例如，即使利用Tm分析也能夠以高靈敏度實(shí)現(xiàn)突變基 因的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種探針，其為用于檢測(cè)JAK2基因的突變的探針，其由下述(X)和(Y)中的至少一種寡核苷酸組成，(X)與以序列號(hào)1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5’方向直至第17～22位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(c)作為3’末端，(Y)由所述(X)的互補(bǔ)序列組成的寡核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述(X)為由選 自序列號(hào)3 ~ 8所組成的組中的至少 一 個(gè)序列號(hào)的石威基序列組成 的寡核苦酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述堿基序列中的 堿基(k)為胸腺嘧啶(t)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述探針為用于檢 測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第73位堿基的突變(g—1)的探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述探針為用標(biāo)記 物標(biāo)記的標(biāo)i己4笨4十。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其中，所述標(biāo)記探針為 單獨(dú)時(shí)顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或?yàn)閱?獨(dú)時(shí)不顯示信號(hào)且通過(guò)雜交而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其中，所述標(biāo)記探針為用 熒光染料標(biāo)記的探針，所述標(biāo)記探針在單獨(dú)時(shí)顯示熒光且通過(guò) 雜交熒光強(qiáng)度減弱。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其中，所述標(biāo)記探針為寡 核苷酸的3 ，末端的胞嘧啶堿基被標(biāo)記的探針。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述探針為用于Tm 分析的探針。
10. —種突變的檢測(cè)方法，其特征在于，其為JAK2基因中的突變的檢測(cè)方法，包含下述工序(A) ~ (C),(A) 準(zhǔn)備反應(yīng)體系的工序，所述反應(yīng)體系含有要檢測(cè)有 無(wú)所述突變的待測(cè)核酸以及權(quán)利要求1所述的纟罙針，(B) 改變上述反應(yīng)體系的溫度，測(cè)定所述待測(cè)核酸與所 述探針形成的雜交體顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的工序，(C) 通過(guò)隨溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng)，確定所述待 測(cè)核酸中有無(wú)所述突變的工序。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中，JAK2基因中 的突變?yōu)樾蛄刑?hào)1中所示的JAK2基因的外顯子12中第73位堿基 的突變(g—t)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中，所述(A) 工序中的所述待測(cè)核酸為利用核酸擴(kuò)增法由模板核酸擴(kuò)增得至)J 的擴(kuò)增產(chǎn)物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的檢測(cè)方法，其中，所述(A) 工序還包括使用引物對(duì)由模板核酸擴(kuò)增待測(cè)核酸的工序。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的檢測(cè)方法，其中，所述引物對(duì) 為包括由下述(F )的寡核苷酸所組成的正向引物和由下述(R) 的寡核苷酸所組成的反向引物的一對(duì)引物，(F):與以序列號(hào)2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區(qū)域序 列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，(R):與以序列號(hào)2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c )作為第 一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區(qū)域互 補(bǔ)的至少 一 個(gè)寡核香酸，該寡核苷酸以與所述第2 5 5位的胞嘧啶 堿基(c)互補(bǔ)的鳥(niǎo)噪呤堿基(g)作為3，末端。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的檢測(cè)方法，其中，所述(F)的寡核苷酸為下述(Fl)的寡核苷酸，所述(R)的寡核苷酸為下述(Rl )的寡核苷酸，(Fl):由序列號(hào)25的堿基序列組成的寡核苷酸， (Rl):由序列號(hào)51的堿基序列組成的寡核苷酸。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中，所述探針為 用熒光標(biāo)記的標(biāo)記^笨針，在上述(B)工序中，測(cè)定所述熒光 標(biāo)記的熒光強(qiáng)度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中，待測(cè)核酸為 生物樣品來(lái)源的核酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的檢測(cè)方法，其中，所述生物樣 品為血液。
19. 一種引物對(duì)，其特征在于，其為用于通過(guò)核酸擴(kuò)增法 擴(kuò)增JAK2基因的引物對(duì)，其包括一對(duì)引物，該一對(duì)引物包含由 下述(F)的寡核苷酸所組成的正向引物及由下述(R)的寡核 苷酸所組成的反向引物(F):與以序列號(hào)2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區(qū)域序 列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核香酸以上述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，(R):與以序列號(hào)2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第 一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區(qū)域互 補(bǔ)的至少 一 個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第2 5 5位的胞嘧咬 堿基(c)互補(bǔ)的鳥(niǎo)噤呤堿基(g)為3，末端。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的引物對(duì)，其中，所述(F)的寡 核苷酸為下述(Fl)的寡核苷酸，所述(R)的寡核香酸為下 述(Rl )的寡核苷酸，(Fl):由序列號(hào)25的堿基序列組成的寡核苷酸，(Rl):由序列號(hào)51的堿基序列組成的寡核苷酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的引物對(duì)，其中，所述引物對(duì)為 用于擴(kuò)增生物樣品來(lái)源的JAK2基因的引物對(duì)。
22. —種突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其為為了在權(quán)利 要求10所述的、JAK2基因中的突變的檢測(cè)方法中使用的突變檢 測(cè)試劑盒，含有權(quán)利要求l所述的探針。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的突變檢測(cè)試劑盒，其中，還含 有權(quán)利要求19所述的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)JAK2基因突變的探針，其在包含僅一個(gè)堿基不同的突變的檢測(cè)對(duì)象序列與不含突變的非檢測(cè)對(duì)象序列共存的情況下，也能檢測(cè)出含所述突變的檢測(cè)對(duì)象序列。使用的探針如下與以序列號(hào)1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子12中第84位的胞嘧啶堿基(C)作為第一位堿基并朝5’方向直至第17～22位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端。通過(guò)在例如Tm分析中使用這些探針，即便是包含發(fā)生突變的JAK2基因與未發(fā)生突變的JAK2基因的樣品，亦能夠檢測(cè)出前者的突變。所述探針優(yōu)選為用熒光染料標(biāo)記的探針。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101622363SQ20088000654
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者前川平, 平井光春, 木村晉也, 間島智史 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社