用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的研宄得到快速發(fā)展，在二代測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域里，以 Illumina，Agilent，Roche，ABI為代表的第二代測(cè)序技術(shù)使測(cè)序成本大大降低，在臨床和科 研中占據(jù)著重要地位。第二代測(cè)序技術(shù)最大的特點(diǎn)是高通量，可以對(duì)數(shù)以?xún)|計(jì)的DNA片段 進(jìn)行同時(shí)測(cè)序。盡管高通量的測(cè)序技術(shù)使測(cè)序成本大大降低，然而測(cè)序一個(gè)人的全基因組 仍需數(shù)千美元，這對(duì)于需要大量臨床樣本進(jìn)行疾病研宄的項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，總測(cè)序成本仍然很高。 更重要的是全基因組測(cè)序的巨大數(shù)據(jù)量使得數(shù)據(jù)分析也是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)。而且目前全基 因組測(cè)序的深度一般為30X，很難達(dá)到一些臨床應(yīng)用的要求。對(duì)于研宄人類(lèi)某些疾病的科 學(xué)家來(lái)說(shuō)，他們并不需要對(duì)全基因組進(jìn)行測(cè)序，他們感興趣的往往只是小部分的基因組區(qū) 域，例如全外顯子區(qū)（相當(dāng)于1 %的人全基因組大?。?，而選擇性對(duì)某些區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，不僅 使測(cè)序成本大大降低，同時(shí)也能縮短測(cè)序時(shí)間。序列捕獲技術(shù)是一種對(duì)基因組特定區(qū)域進(jìn) 行選擇性富集的技術(shù)，將目標(biāo)區(qū)域從基因組中分離出來(lái)，然后再對(duì)該目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，這 對(duì)于低成本地有針對(duì)性的進(jìn)行基因組學(xué)研宄有非常重要的意義。
[0003] 目前常用的序列捕獲方法主要有，多重PCR，液相雜交法。PCR法具有高靈敏性、高 特異性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。PCR富集法在二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)目前主要用于捕獲一些小的區(qū) 域，特別是一些連續(xù)的區(qū)域。對(duì)于較大的非連續(xù)的區(qū)域，如全外顯子，PCR富集法的適用性受 到較大的限制。盡管微滴PCR等技術(shù)在一定程度上緩解了上述部分問(wèn)題，然而實(shí)際上這些 PCR反應(yīng)由于在同一反應(yīng)中使用多種引物，導(dǎo)致大量非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，并且容易出現(xiàn)部 分區(qū)域無(wú)法擴(kuò)增的情況，目前生產(chǎn)這類(lèi)產(chǎn)品代表性的是ABI公司。
[0004] 目前基于雜交的序列捕獲技術(shù)是二代測(cè)序平臺(tái)中使用較多的序列富集方法，主要 分為固相雜交和液相雜交。固相雜交序列捕獲技術(shù)是一種將寡核苷酸探針合成在芯片上， 并在芯片上進(jìn)行雜交的高通量序列捕獲技術(shù)，可以在一個(gè)芯片上捕獲整個(gè)外顯子甚至更大 的區(qū)域。但因?yàn)樾酒系墓押塑账崃枯^少，所以就需要較大的樣本起始量來(lái)推動(dòng)雜交的發(fā) 生。而液相雜交技術(shù)是通過(guò)將芯片上合成的探針剪切回收后進(jìn)行擴(kuò)增富集而構(gòu)建用于雜交 目的的雜交探針庫(kù)，液相雜交在動(dòng)力學(xué)上相對(duì)固相雜交更具優(yōu)勢(shì)，能降低對(duì)于樣品起始量 的要求。相對(duì)于液相雜交而言，固相雜交已逐漸被淘汰，而液相雜交中的探針又可分為RNA 探針和DNA探針。目前有代表性的兩家公司分別為Agilent和IDT, Agilent主要生產(chǎn)RNA 探針，而IDT主要生產(chǎn)DNA探針。RNA探針運(yùn)輸以及保存均不方便，相對(duì)于DNA來(lái)講成本要 更高一些。而IDT的DNA探針的合成是通過(guò)柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成 的，相對(duì)與全外顯子的量，合成的的代價(jià)也是極其昂貴的，是極不易于推廣的。雖然Agilent 和IDT的探針都是單鏈，相對(duì)雜交的驅(qū)動(dòng)力來(lái)講幾乎是一致的，但它們都極其昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的：提供一種用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，包括捕獲目標(biāo)基 因的探針制備技術(shù)及其在二代測(cè)序中的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，該方法至少包括如下步驟：
[0008] 步驟1 :制備探針。
[0009] 步驟2 :捕獲目標(biāo)DNA。
[0010] 步驟3 :進(jìn)行洗脫程序。
[0011] 步驟4 :用高保真酶的反應(yīng)擴(kuò)增體系進(jìn)行捕獲目標(biāo)DNA后擴(kuò)增。
[0012] 步驟5 :擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠純化后，用Nanodrop定量至20ngAil，分裝保存。
[0013] 步驟6 :用Real-time PCR方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照序列進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證捕獲效率。
[0014] 上述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其中，在所述的步驟1中，至少包括 如下分步驟：
[0015] 步驟1. 1 :合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含120bp 目標(biāo)區(qū)域和通用的15個(gè)堿基末端：
[0016] 5^ -ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3'。
[0017] 步驟1. 2 :把合成的寡核苷酸庫(kù)溶于400ul的低濃度TE中。
[0018] 步驟1. 3 :每個(gè)寡核苷酸的濃度為fmol級(jí)別，擴(kuò)增得到所需濃度。
[0019] 步驟1.4 :用4%膠跑PCR產(chǎn)物，然后回收150bp大小的PCR產(chǎn)物，溶解到100ul水 中。
[0020] 步驟1. 5 :為了得到帶生物素的單鏈的寡核苷酸片段，需要把PCR進(jìn)行解鏈。
[0021] 上述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其中，在所述的步驟1. 3中，
[0022] 引物序列具體為：A 5' Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3'
[0023]B 5， -CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3，。
[0024] 上述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其中，在所述的步驟1. 3中，擴(kuò)增條 件為：制備3個(gè)50ul PCR mix，模板分別為lul，2ul，5ul
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于：該方法至少包括如下步 驟： 步驟1 ;制備換針； 步驟2 ;捕獲目標(biāo)DNA; 步驟3 ;進(jìn)行洗脫程序； 步驟4 ;用高保真酶的反應(yīng)擴(kuò)增體系進(jìn)行捕獲目標(biāo)DNA后擴(kuò)增； 步驟5 ;擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠純化后，用Nano化op定量至20ng/ul，分裝保存； 步驟6 ;用Real-timePCR方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照序列進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證捕獲效率。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟1中，至少包括如下分步驟： 步驟1. 1 ;合成12K，60K，90K等不同寡核巧酸數(shù)量的巧片，所述的巧片包含12化P目標(biāo) 區(qū)域和通用的15個(gè)堿基末端： 5' -ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3'; 步驟1. 2 ;把合成的寡核巧酸庫(kù)溶于400ul的低濃度TE中； 步驟1. 3;每個(gè)寡核巧酸的濃度為fmol級(jí)別，擴(kuò)增得到所需濃度； 步驟1. 4 ;用4%膠跑PCR產(chǎn)物，然后回收150bp大小的PCR產(chǎn)物，溶解到lOOul水中； 步驟1. 5;為了得到帶生物素的單鏈的寡核巧酸片段，需要把PCR進(jìn)行解鏈。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟1.3中， 引物序列具體為；A5'Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3' B5' -CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟1. 3中，擴(kuò)增條件為：制備3個(gè)50ulPCRmix,模板分別為lul，化1，加1
PCR反應(yīng)條件如下。
o
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟1. 5中，還包括如下步驟： 步驟 1. 5. 1 ;用IXbindingbuffer漂洗lOOulDynabeadS? 3 次，懸浮 2Xbinding buffer,總體積是lOOul; 步驟1. 5. 2 ;把looul的Dynabeads⑥加入到looulPCR產(chǎn)物，禍旋震蕩混勻，使用 移液器輕輕吹打10次充分混勻，室溫解育5分鐘； 步驟1. 5. 3 ;將反應(yīng)管短暫離屯、并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清5分鐘， 移除上清； 步驟1. 5. 4 ;保持PCR管始終處于磁力架中，用IXTE清洗2次，移除上清； 步驟1. 5. 5 ;加入lOOul0. 1M的化0H，禍旋震蕩混勻，使用移液器輕輕吹打10次充分 混勻，室溫解育5分鐘； 步驟1. 5. 6 ;將反應(yīng)管短暫離屯、并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清5分鐘， 移除上清，移除的上清即為未標(biāo)記生物素的DNA單鏈； 步驟1. 5. 7 ;保持PCR管始終處于磁力架中，用IXTE清洗2次； 步驟1.5.8;將反應(yīng)管從磁力架中取出，加入10〇11195%甲酯胺，1〇1111邸14，抑8.2， 65解育2minutes，禍旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻； 步驟1. 5. 9 ;將反應(yīng)管置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后，吸取上清至滅菌EP管中，吸取的上清即為生物素標(biāo)記的DNA單鏈； 步驟1. 5. 10 ;用基于特異性識(shí)別雙鏈DNA的巧光染料法進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行定量，DNA濃度一 般為 100-200ng/ul。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟2中，至少包括如下分步驟： 步驟 2. 1 ;制備如下混合液；3. 5ul500ngDNA庫(kù)、1. 5ul200uM的AdaptorBlock及 5ulc過(guò)ptureprobe; 步驟 2. 2;在PCR儀中，95°C7min，65°C5min; 步驟2. 3 ;加入lOul65°C預(yù)熱的2X雜交液； 步驟2. 4 ;在PCR儀上65°C雜交2化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟3中，至少包括如下分步驟： 步驟3. 1;用IXbindingbuffer漂洗lOOulDynabeadS? 3次，懸浮于200ulIX bindingbuffer中； 步驟3. 2;把20ul雜交產(chǎn)物加入到200ulDynabeadS?IXbindingbuffer中，禍 旋震蕩混勻，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻，室溫?fù)u動(dòng)解育30分鐘； 步驟3. 3;將反應(yīng)管短暫離屯、并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清5分鐘，移 除上清； 步驟3. 4;保持1. 5ml管始終處于磁力架中，用0. 5mlIXSSC/0. 1%SDS清洗15min;步驟3. 5 ;用65°C溫浴的0. 5ml0.IXSSC/0. 1%SDS洗3次； 步驟3. 6 ;將反應(yīng)管短暫離屯、并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清5分鐘，移 除上清； 步驟3. 7 ;加入50y1滅菌超純水，禍旋震蕩混勻，使用移液器輕輕吹打10次充分混 勻，室溫解育5分鐘，捕獲的DNA還在生物素結(jié)合的磁珠上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟4中，所述的擴(kuò)增條件為：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，其特征在于；在所述 的步驟4中，PCR反應(yīng)條件如下。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于多基因捕獲測(cè)序的探針制備方法，該方法至少包括如下步驟：步驟1：制備探針。步驟2：捕獲目標(biāo)DNA。步驟3：進(jìn)行洗脫程序。步驟4：用高保真酶的反應(yīng)擴(kuò)增體系進(jìn)行捕獲目標(biāo)DNA后擴(kuò)增。步驟5：擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠純化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分裝保存。步驟6：用Real-time PCR方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照序列進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證捕獲效率。本發(fā)明利用芯片技術(shù)合成了一種單鏈DNA捕獲探針，包括DNA芯片合成，探針切割，核苷酸擴(kuò)增，DAN解鏈得到單鏈的生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針池。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12N15-10, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104789687
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510232619
【發(fā)明人】張道允, 鞏子英
【申請(qǐng)人】上海允英醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月8日