一種基于混合探針基因芯片檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因芯片質(zhì)量控制方法，具體涉及一種基于混合探針基因芯片檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因芯片技術(shù)作為近年來快速發(fā)展的一項(xiàng)生物高新技術(shù)，為解決怎樣研究基因在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能提供了光輝的前景?；蛐酒夹g(shù)是指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品序列信息。
[0003]與傳統(tǒng)核酸印跡雜交方法相比，基因芯片同時將大量根據(jù)靶基因的特征及檢測要求預(yù)先設(shè)計(jì)好的探針固定在支持物表面，一次雜交可檢測和分析樣品中多種靶基因的相關(guān)信息，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足，使基因芯片技術(shù)具有了高通量、多參數(shù)同步分析，快速全自動分析，高精確度分析，高靈敏度分析的特點(diǎn)。但用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與匹配探針雜交對未知DNA序列片段進(jìn)行檢測的方法本身也存在缺陷:
I)基因芯片熒光檢測主要依賴于檢測結(jié)果的熒光強(qiáng)度，沒有熒光強(qiáng)度或者熒光強(qiáng)度弱的即判斷為陰性，但在陰性的結(jié)果中無法確定是否是探針固定上；2)多種基因芯片技術(shù)平臺得到的研究結(jié)果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成為目前基因技術(shù)研究的熱點(diǎn)，尤其是應(yīng)用型基因芯片尚無一些準(zhǔn)確、高效地有效性檢測方法，其應(yīng)用的推廣尚有困難。因此發(fā)展一種準(zhǔn)確、高效地有效性檢測方案來檢測探針是否固定成為一種迫切的需要。
[0004]基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探針、支持物制備的有效性控制、探針在支持物上的固定效率即基因芯片制備的有效性控制，以及基因芯片檢測時的有效性控制、檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化等一系列問題。本專利主要針對的是制備有效性的基因芯片。
[0005]制備有效性基因芯片的傳統(tǒng)方法有以下幾種:1)利用熒光DNA染料對單鏈DNA探針染色，根據(jù)熒光DNA染料強(qiáng)度來估計(jì)芯片的有效性；2)利用目的探針3點(diǎn)樣液和帶熒光I質(zhì)量控制探針4點(diǎn)樣液分別點(diǎn)樣于修飾了手臂分子6的基質(zhì)7上，形成各自的斑點(diǎn)，然后使目的探針3在目斑點(diǎn)處與帶有同種或異種熒光2的待測DNA序列5雜交，根據(jù)質(zhì)量探針點(diǎn)樣位置是否發(fā)熒光，估計(jì)芯片的有效性，根據(jù)目的探針點(diǎn)位置是否發(fā)熒光，判定待測DNA序列信息，如圖1所示。但是以上的這些方法都無法直接、有效地評價芯片制備的質(zhì)量。
[0006]這些傳統(tǒng)基因芯片質(zhì)量控制的方法可減少了基因檢測中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，在一定程度上提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，但通常傳統(tǒng)基因芯片的缺陷是其自身質(zhì)量無法得到較好的控制，本發(fā)明提出了一種基因芯片有效性控制方法，能夠?qū)蛐酒挠行赃M(jìn)行控制，大大提高其檢測的可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于混合探針基因芯片檢測方法，能較直接地檢測探針是否固定在基片上，以排除因探針缺失而造成的陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，提聞了基因芯片檢測的準(zhǔn)確性和可罪性。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明基于混合探針基因芯片檢測方法，包括以下幾個步驟:
步驟一:樣品制備
制備含有目的探針的溶液，和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的質(zhì)量控制探針的溶液；并將上述目的探針的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記的質(zhì)量控制探針的溶液充分混合，制備成點(diǎn)樣溶液。
[0009]步驟_.:基因芯片制備
將上述混合后的溶液點(diǎn)樣于修飾了手臂分子的基片上形成N個探針斑點(diǎn)，N為自然數(shù)，經(jīng)過固定并清除未固定的探針，完成基因芯片的制備。
[0010]步驟三:通過檢測質(zhì)量控制探針的信號檢測目的探針通過手臂分子固定在基片上檢測上述所有探針斑點(diǎn)發(fā)出的熒光信號，若在第一熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下檢測到熒光，則表示質(zhì)量控制探針通過手臂分子固定在基片上，同時說明目的探針通過手臂分子固定在基片上，從而判定基因芯片質(zhì)量合格。
[0011]否則，若任一個探針斑點(diǎn)中在第一突光基團(tuán)的激發(fā)波長下未檢測到突光，表不質(zhì)量控制探針未通過手臂分子固定在基片上，判定為基因芯片質(zhì)量不合格。
[0012]本發(fā)明基于混合探針基因芯片檢測方法，還包括以下步驟:
步驟四:雜交
將第二熒光基團(tuán)標(biāo)記的待測序列與質(zhì)量合格的基因芯片上所述的探針斑點(diǎn)中的目的探針進(jìn)行雜交，雜交后，目的探針中的探針和待測序列結(jié)合形成雜交產(chǎn)物。
[0013]步驟五:確定待測序列的序列信息
對所述雜交產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下檢測到熒光，則確定目的探針與待測序列互補(bǔ)，并確定待測序列的序列信息。
[0014]若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下未檢測到熒光，則表示不能確定目的探針與待測序列互補(bǔ)，也不能確定待測序列的序列信息。
[0015]所述的目的探針和質(zhì)量控制探針為脫氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
[0016]所述的基片為玻璃片、硅膠晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微型磁珠或者管蓋。
[0017]所述的第一熒光基團(tuán)和所述的第二熒光基團(tuán)可為Cy3、Cy5、Fite, FAM或者Rhodamine，但是所述的第一熒光基團(tuán)和所述的第二熒光基團(tuán)使用時不相同，并且在檢測時兩種熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射峰要大于40nm的差異，防止兩者在檢測時由于吸收峰重疊而無法正確得出結(jié)果。
[0018]所述的第一熒光基團(tuán)和第二熒光基團(tuán)為生物素-親和素與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記復(fù)合物。
[0019]所述的標(biāo)記物質(zhì)為熒光蛋白、鐵蛋白、膠體金、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
[0020]本專利所提的目的探針是一段已知的核酸或核酸類似物序列片斷，并在核酸或核酸類似物鏈上修飾了活性基團(tuán)，可通過化學(xué)反應(yīng)固定在被修飾手臂分子的基底上；質(zhì)量控制探針是一段已知的、較短的核酸或核酸類似物序列片斷，一端修飾了活性基團(tuán)，可通過化學(xué)反應(yīng)固定在被修飾手臂分子的基底上，另一端標(biāo)記了發(fā)光基團(tuán)或標(biāo)記復(fù)合物；待測序列是一段未知的核酸或核酸類似物序列片斷，末端標(biāo)記了發(fā)光基團(tuán)或標(biāo)記復(fù)合物；手臂分子是多個碳原子組成兩端均含有活性基團(tuán)的小分子有機(jī)化合物，一端活性基團(tuán)可與基底發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，另一端活性基團(tuán)可與修飾了活性基團(tuán)的核酸或核酸類似物鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
I)傳統(tǒng)的檢測，只是把一定濃度的質(zhì)量控制探針固定在目的探針的周圍，質(zhì)量控制探針與目的探針分開點(diǎn)樣于基片上，沒有考慮到目的探針與待測DNA序列的雜交通常位于固相表面，有一定程度的空間阻礙，若目的探針濃度過高，導(dǎo)致目的探針固定不上去，而本發(fā)明是將質(zhì)量控制探針和目的探針充分混合后再固定，為目的探針與待測DNA序列的提供足夠的雜交空間位置，這樣大大方便了待檢測的DNA序列與目的探針雜交。
[0022]2)本發(fā)明目的探針與較短熒光基團(tuán)標(biāo)記的質(zhì)量控制探針混合，因目的探針、質(zhì)量控制探針有著相同的活性基團(tuán)，又與手臂分子有著共同的化學(xué)結(jié)合方式，固定在基片上，所以通過檢測第一熒光基團(tuán)，確定質(zhì)量控制探針的固定于基片上，可間接確定目的探針固定在基片上，保證了芯片制作的質(zhì)量，這種方式也達(dá)到實(shí)時監(jiān)測整個芯片的有效性。
[0023]3)本發(fā)明通過檢測第一熒光基團(tuán)，確定基因芯片的質(zhì)量，提供了可靠的陰性判定方法，這種陰性結(jié)果，不會因?yàn)樘结樄潭ㄐ识淖儯驗(yàn)樘结樄潭ㄐ实蜁r，第一熒光基團(tuán)的信號會非常低甚至沒有信號，同時也能排除基因芯片雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中假陽性錯判，而對于存在檢測雜交信號弱而檢測雜交信號強(qiáng)，也可以得到真陰性結(jié)果，從而解決了因基因芯片質(zhì)量問題對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾問題。
[0024]4)本專利發(fā)明了一種基于混合探針基因芯片檢測方法，應(yīng)用于基因芯片制備中能夠大大提高基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。同時，不僅可以為基因芯片的制造者提供質(zhì)量控制的方法提高生產(chǎn)質(zhì)量，又可以為基因芯片的使用者在使用之前對芯片做出評價，簡單有效地查出實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題，從而減少了實(shí)驗(yàn)中的分析過程，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
【附圖說明】
[0025]圖1是現(xiàn)有技術(shù)中檢測基因芯片有效性的方法的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明基于混合探針基因芯片檢測方法的整體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明基于混合探針基因芯片檢測方法的局部放大結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖中:1、第一熒光基團(tuán)，2、第二熒光基團(tuán)，3、目的探針，4、質(zhì)量控制探針，5、待測DNA序列，6、手臂分子，7、基片。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0028]本發(fā)明基于混合探針基因芯片檢測方法，包括以下幾個步驟:
1、樣品制備
如圖2、3所示，制備含有目的探針3的溶液，和第一熒光基團(tuán)I標(biāo)記的質(zhì)量控制探針4的液；并將上述目的探針3的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記I標(biāo)記的質(zhì)量控制探針4的點(diǎn)樣溶液充分混合，制備成點(diǎn)樣溶液。
[0029]2、基因芯片制備
將上述混合后的溶液點(diǎn)樣于修飾了手臂分子6的基片7上形成N個探針斑點(diǎn)，N為自然數(shù)，經(jīng)過固定并清除未固定的探針，完成基因芯片的制備。