一種朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒及其檢查方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒及其檢查方法，屬于家禽病害防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]朗德鵝原產(chǎn)于法國(guó)西南部的朗德地區(qū)，體型中等，羽毛灰褐色，頸部接近黑色，腹部毛色呈銀灰色。郎德鵝生長(zhǎng)速度快，8周齡體重可達(dá)4.5?5kg，作為商品鵝出售，成年體重7?8kg，羽絨產(chǎn)量較高。耐人工拔羽，通常種鵝每年拔羽兩次。可產(chǎn)羽絨350?450g ;肝用性能好，是世界上最適于生產(chǎn)鵝肥肝的鵝種。其肉質(zhì)細(xì)嫩，瘦肉率高，膽固醇含量低，富含多種氨基酸，具有野禽肉的味道。耐粗飼，適應(yīng)性強(qiáng)，成活率高，是進(jìn)行養(yǎng)殖的理想品種。
[0003]大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌是目前引起朗德鵝發(fā)病的三種常見(jiàn)重要致病菌。當(dāng)前，對(duì)這些致病菌的檢驗(yàn)我們大多仍沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)及生化鑒定等方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度低，而且每次只能檢測(cè)出一種致病菌，而很多時(shí)候會(huì)出現(xiàn)混合感染，目前的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法明顯滯后。
[0004]因此，建立快速敏感和特異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于盡快明確致病因素和采取有效的預(yù)防和治療措施都是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒及其檢查方法，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度低，而且每次只能檢測(cè)出一種致病菌等問(wèn)題。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒及其檢查方法，包括以下成分:EX_Taq酶、1XEX-Taq buffer、dNTP mixture、ddH20和三對(duì)特異性引物，其中第一對(duì)引物是:
[0008]Pl:5’TCG CTG GCG GTG TTG AGT AC 3’ ；
[0009]P2:5’ TCC AGA GCA GCC TGA CCT TC 3’ ；
[0010]第二對(duì)引物是:
[0011]P3:5' AAA AGA AGG GTC GTC GTT AG 3’ ；
[0012]P4:5’GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC 3’ ；
[0013]第三對(duì)引物是:
[0014]P5:5' GCA GGAGGA ACA GGA GGG TG 3’ ；
[0015]P6:5’TCT TCG GCG TTA GCA ATC AT 3’。
[0016]本發(fā)明也提供了一種朗德鵝三種致病菌的的方法，利用本發(fā)明的試劑盒，包括以下步驟:
[0017](I)臨床樣品檢測(cè):將臨床采集保存的朗德鵝疑似病例其肝、脾組織，研磨后用滅菌生理鹽水1:5的重量比例稀釋，稀釋病料中加入增菌培養(yǎng)基500 μ 1，使病料在培養(yǎng)基中的比例為20%，37°C搖振培養(yǎng)2?4h，將培養(yǎng)物10000r/min離心，去除上清，剩余培養(yǎng)物吹打均勻，99°C水浴10?15min，作為DNA模板，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)；
[0018](2)多重PCR體系的建立:采用50 UL反應(yīng)體系，其中EX-Taq酶0.25 μ L, 1XEX-Taq buffer 5 yL, dNTP mixture 4 μ L, Pl、P2、P3、P4、P5、P6 各0.2 μ L, DNA 模板 2 μ L，加 ddH20 至 50 μ L，
[0019]PCR 擴(kuò)增程序:94°C，5min ;94°C，20s ；50-58°C, 50s ;72°C，40s ;30 個(gè)循環(huán)；
[0020]72°C延伸5min，50?58°C退火，PCR產(chǎn)物在進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像；
[0021](3)結(jié)果判斷:如果電泳結(jié)果出現(xiàn)大小約266bp的條帶，則判定出現(xiàn)大腸桿菌感染，如果電泳結(jié)果出現(xiàn)大小約445bp的條帶，則判定出現(xiàn)多殺性巴氏桿菌感染，如果電泳結(jié)果出現(xiàn)大小約801bp的條帶，貝U判定出現(xiàn)沙門(mén)氏菌感染。
[0022]進(jìn)一步，本發(fā)明的一種優(yōu)選方案:退火溫度為55°C。選擇50?58°C退火的退火溫度，三條引物均能比較清晰的條帶，但當(dāng)溫度再提高時(shí)擴(kuò)增出的片段會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。尤其是選擇55°C為三重PCR方法的退火溫度，條帶最清楚。
[0023]本發(fā)明的試劑盒對(duì)三種菌的檢測(cè)下限為105CFU/mL。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025]本發(fā)明的試劑盒:多重PCR的陽(yáng)性檢出率高于傳統(tǒng)方法，大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌三重PCR快速檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、特異性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能在較少時(shí)間內(nèi)同時(shí)快速檢測(cè)病料中可能的3種致病菌。
[0026]本發(fā)明的試劑盒采用的3對(duì)引物對(duì)檢測(cè)的所有的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌均為陽(yáng)性，但對(duì)其他所測(cè)的金黃色葡萄球菌、鴨疫里氏桿菌、溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽胞桿菌等細(xì)菌均為陰性，引物特異性良好。
【附圖說(shuō)明】
[0027]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0028]圖1為試劑盒特異性電泳圖，
[0029]圖中I和14為DL2000DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2、3、5為大腸桿菌，4為李斯特菌，6為金黃色葡萄球菌，7和8.為沙門(mén)氏菌，9和10.為鴨疫里氏桿菌，11?13為多殺性巴氏桿菌，15為鏈球菌，16為綠膿桿菌，17為枯草芽胞桿菌；
[0030]圖2為樣品檢測(cè)結(jié)果的電泳圖，
[0031]圖中I為DL2000DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2-17為臨床檢測(cè)樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0033]實(shí)施例1
[0034]按照下列配方制備朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒，包括EX-Taq酶、1XEX-Taq buffer、dNTP mixture、ddH20和三對(duì)特異性引物(引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)，其中第一對(duì)引物是:
[0035]Pl: 5’TCG CTG GCG GTG TTG AGT AC 3’ (SEQ ID N0.1)；
[0036]P2: 5，TCC AGA GCA GCC TGA CCT TC 3，(SEQ ID N0.2)；
[0037]第二對(duì)引物是:
[0038]P3:5，AAA AGA AGG GTC GTC GTT AG 3(SEQ ID N0.3)’ ；
[0039]P4:5’GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC 3’ (SEQ ID N0.4)；
[0040]第三對(duì)引物是:
[0041]P5:5’GCA GGA GGA ACA GGA GGG TG3’ (SEQ ID N0.5)；
[0042]P6:5，TCT TCG GCG TTA GCA ATC AT 3，(SEQ ID N0.6)。
[0043]實(shí)施例2
[0044]利用朗德鵝三種致病菌的快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，包括以下步驟:
[0045](I)菌株的培養(yǎng):將大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到TSB2YE培養(yǎng)基中，370C，160r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算3種致病菌培養(yǎng)液濃度，相同濃度等量混合，按10倍梯度稀釋，然后將不同梯度的稀釋液進(jìn)行多重PCR檢測(cè):
[0046](2)基因組DNA的提取:取步驟(I)中混合好的的菌液50 μ I置于1.5ml離心管中，99°C水浴10?15min，作為多重PCR的DNA模板；
[0047](3)多重PCR體系的建立:采用50 μ L反應(yīng)體系，其中EX-Taq酶0.25 μ L, 1XEX-Taq buffer 5 yL, dNTP mixture 4 μ L, Pl、P2、P3、P4、P5、P6 各0.