一種基于細(xì)胞生物物理特性的抗肺纖維化藥物活性評價(jià)體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于細(xì)胞生物物理特性的抗肺纖維化藥 物活性評價(jià)體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著我國空氣污染形勢的日益嚴(yán)峻，以空氣污染為潛在誘發(fā)因素的諸多 疾病備受關(guān)注，其主要集中在呼吸系統(tǒng)疾病方面，而間質(zhì)性肺病作為呼吸系統(tǒng)疾病重要的 組成部分成為主要研宄對象之一。其中，以特發(fā)性肺纖維化（IPF)最具代表性，它是一種以 肺實(shí)質(zhì)纖維化為主要特征的間質(zhì)性肺病。IPF作為多種間質(zhì)性肺病共同的惡化發(fā)展最終形 式而普遍存在，初次確診后的中位存活年限為2-3年，是大多數(shù)間質(zhì)性肺病的直接致死因 素。
[0003]目前臨床對IPF的治療方案主要基于免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在肺纖維化過程中的協(xié) 同作用，聯(lián)合使用抗炎，免疫抑制藥物以延緩纖維化進(jìn)程，該方案因其療效的不確定性以及 不良反應(yīng)復(fù)雜性而未能廣泛應(yīng)用。而肺移植雖然是纖維化末期唯一有效的治療手段，但它 同樣面臨器官供體缺乏，手術(shù)成活率低，術(shù)后難恢復(fù)等問題。由此可見，特異性強(qiáng)、療效確切 的抗肺纖維化藥物極其缺乏。
[0004] 成熟穩(wěn)定的肺纖維化病理模型是活性化合物篩選的基礎(chǔ)，當(dāng)前普遍應(yīng)用的肺纖維 化模型主要為在體動物模型，選用抗腫瘤藥物博萊霉素，利用其誘發(fā)肺間質(zhì)纖維化的副作 用，通過氣管注射給藥形成肺纖維化動物模型。該模型主要以肺組織切片的組織形態(tài)學(xué)特 征作為考察指標(biāo)，該模型從整體水平直觀反映纖維化程度，具有較高的臨床參考價(jià)值。然而 該模型同樣存在模型動物個(gè)體差異大，纖維化程度定量難，觀測周期長，造模成本高，給藥 量大等不足。單獨(dú)應(yīng)用該模型無法充分滿足活性化合物高效篩選的需要?，F(xiàn)有的體外模型 中，肺上皮細(xì)胞A549經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子e(TGF-e)誘導(dǎo)造模成纖維化狀態(tài)為公認(rèn)的抗纖維 化體外模型，目前的技術(shù)對此模型的評價(jià)多采用免疫學(xué)的檢測方法，如E-cadherin、a-SMA 和vimentin等蛋白的表達(dá)，由于以上技術(shù)操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、缺乏系統(tǒng)性因而不能快速 提供準(zhǔn)確的定量信息，且以上蛋白表達(dá)的改變并不能準(zhǔn)確反應(yīng)纖維化的進(jìn)程，同時(shí)評價(jià)結(jié) 果不能可視化，因此，急需一種操作簡單、結(jié)果可靠的抗纖維化藥物篩選技術(shù)體系，以便快 速的、準(zhǔn)確的、高通量的對候選化合物進(jìn)行抗纖維化活性的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的抗肺纖維化藥物活性評價(jià)體系存在的不足，發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研 宄，基于經(jīng)典的體外肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)了肺上皮細(xì)胞A549造模前后及藥物處治前后的生 物物理特性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較存在顯著差異，從而通過細(xì)胞生物物理特性的變化來評價(jià) 抗肺纖維化藥物的活性。通過主成分分析法統(tǒng)計(jì)比較，將細(xì)胞硬度作為主要評價(jià)指標(biāo)建立 一種定量的、快速的、可視化的抗肺纖維化藥物活性評價(jià)體系。
[0006] 本發(fā)明提供種一種基于細(xì)胞生物物理特性的抗肺纖維化藥物活性評價(jià)體系，該評 價(jià)方法的步驟為：
[0007]a.細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，前期處理得到待測樣品；
[0008] b.對步驟a所得對照組、模型組及給藥組細(xì)胞的硬度、長度及表面粗糙度進(jìn)行檢 測，得到評價(jià)指標(biāo)值；
[0009] C.將對照組與模型組，模型組及給藥組的細(xì)胞硬度評價(jià)指標(biāo)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析，得出模型成功與否及有無抗纖維化活性的評價(jià)結(jié)果。
[0010] 上述步驟a模型組選取肺上皮細(xì)胞A549經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-e)誘導(dǎo)，形成 肺纖維化體外模型；給藥組選取的陽性藥為N-乙酰-L-半胱氨酸。
[0011] 發(fā)明人實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)刺激前后其微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)及機(jī) 械特性等物理特征存在明顯差異。如細(xì)胞的形狀及其表面粗糙度，經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)刺激后， 細(xì)胞會從原來的卵圓形變?yōu)樗笮?、而其表面粗糙度較刺激前顯著增加；再如，細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng) 度，即，細(xì)胞的硬度值，造模后顯著增高。反之，陽性藥預(yù)先處治后，以上由TGF-0誘導(dǎo)的細(xì) 胞生物物理特征的轉(zhuǎn)變將會被抑制；根據(jù)上述細(xì)胞生物物理特性指標(biāo)在肺纖維化體外模型 藥物處治前后的對應(yīng)關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)明人建立了本發(fā)明所述的抗肺纖維化藥物活 性評價(jià)體系。本發(fā)明僅需在體外的細(xì)胞水平，便可進(jìn)行可視化的、準(zhǔn)確的定量分析，從而對 藥物的抗纖維化活性進(jìn)行評價(jià)，該評價(jià)方法檢測成本低，耗時(shí)短，可滿足快速大量篩選的要 求。
[0012] 所述步驟a的細(xì)胞為肺上皮細(xì)胞，前期處理包括轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0)及其他 可誘導(dǎo)細(xì)胞形成纖維化的刺激因子。
[0013] 所述步驟b的檢測，可選用能對細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性進(jìn)行精確成像的分析 儀器，優(yōu)選采用原子力顯微鏡（AFM)。
[0014] 所述步驟c的評價(jià)結(jié)果通過以下標(biāo)準(zhǔn)判斷得出：
[0015] 模型成功：模型組細(xì)胞硬度較對照組增加，且模型組與對照組細(xì)胞硬度經(jīng)統(tǒng)計(jì)分 析比較，顯著性P〈〇. 05時(shí)；
[0016] 藥物有效：給藥組細(xì)胞硬度較模型組降低，給藥組與模型組細(xì)胞硬度經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析 比較，顯著性P〈〇. 05時(shí)。
[0017] 所述步驟a中的細(xì)胞培養(yǎng)及造模方法、所述步驟b的檢測方法，均可采用本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為三組樣品細(xì)胞的表面形貌圖；
[0019] 其中A、B、C依次為A549細(xì)胞、經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)的A549細(xì)胞、經(jīng)TGF-0與NAC共同 處治的A549細(xì)胞的70ym范圍內(nèi)AFM偏差圖，a、b、c為每種細(xì)胞對應(yīng)的10ym局部微觀形 貌圖。
[0020] 圖2為三組樣品細(xì)胞的高斯擬合圖及對應(yīng)力曲線；
[0021] 其中A、B、C分別為A549細(xì)胞、經(jīng)TGF-0誘導(dǎo)的A549細(xì)胞、經(jīng)TGF-0與NAC共同 處治的A549細(xì)胞的高斯擬合圖，a、b、c分別為其相應(yīng)力曲線；
[0022] 圖3為三種標(biāo)志蛋白免疫熒光結(jié)果圖；
[0023] 其中A為E-cadherin檢測結(jié)果，B為a -SMA檢測結(jié)果，C為vimentin檢測結(jié)果；
[0024] 圖4為三種標(biāo)志蛋白Western blotting結(jié)果圖；
[0025] 其中A為蛋白條帶結(jié)果圖，B為半定量統(tǒng)計(jì)柱形圖，*與對照組比較，P〈0. 05 ;#與 模型組比較，P〈〇. 05 與對照組比較，P〈0. 01 ;##與模型組比較，P〈0. 01。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 發(fā)明人進(jìn)一步通過具體實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明篩選方法。
[0027] 再次重申：以下實(shí)驗(yàn)只是本發(fā)明研制過程中眾多試驗(yàn)中的舉例性實(shí)驗(yàn)，并未涵蓋 和窮盡了發(fā)明人為本發(fā)明所做的所有實(shí)驗(yàn)，目的僅僅在于用那些數(shù)據(jù)來闡述本發(fā)明評價(jià)方 法的直觀性及準(zhǔn)確性等。
[0028] 一、基于免疫學(xué)分析的抗肺纖維化模型及陽性藥的抗纖維化活性的確認(rèn)
[0029] 1、免疫熒光染色檢測觀察肺纖維化標(biāo)志性蛋白的表達(dá)
[0030] (1)實(shí)驗(yàn)方法
[0031] ①樣品制備
[0032] 取對