專利名稱:用缺乏l-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法
本發(fā)明是有關(guān)用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法。下面稱之為L-絲氨酸脫氨酶，它的活性本質(zhì)與尿酸梭菌分離出的一種酶相似。它已被命名為EC4，2，1，14，下面稱之為L-絲氨酸脫氨的活性，參見卡特(Carter J·F·)和塞耶斯(Sa-yers·R·D)的文章“尿酸梭菌”、發(fā)表在細(xì)菌學(xué)雜志(J·Bacte-rial)109期，757-763頁(1972年)。發(fā)明特別與利用L-絲氨酸脫氨酶(L-SD)活性缺乏的大腸桿菌K12的幾個(gè)突變菌株有關(guān)。
用微生物從碳水化合物中生產(chǎn)L-色氨酸現(xiàn)有技術(shù)中有兩種方法來完成。第一個(gè)是選擇抗色氨酸及類似物的反饋物的野生型微生物的突變菌株。這種方法的例子包括抗-5氟色氨酸的一個(gè)枯草芽桿菌的菌株(Bacillus substilis)。(見美國專利4，363，875)抗5-甲基色氨酸的短桿菌屬的一些種(Brevi bacterium)(見美國專利3，700，539);及其它需要苯丙氨酸和酪氨酸，並且抗4-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-氟色氨酸、酪氨酸-氧酸鹽(酯)和苯丙氨酸-氧酸鹽(酯)的各氨酸棒桿菌(ATCC21851)。后一個(gè)菌株可以利用15克/10毫升甘蔗赤糖糊密糖轉(zhuǎn)化的蔗糖生產(chǎn)出16.8毫克/升的色氨酸。
第二個(gè)增加色氨酸生產(chǎn)的方法是提供一個(gè)質(zhì)粒和幾個(gè)質(zhì)粒上攜帶控制色氨酸生物合成遺傳信息給宿主微生物。后一個(gè)方法的例子是美國專利4，371，614所述的通過攜帶色氨酸生物合成信息的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏色氨酸酶的大腸桿菌宿主〔EC4、1，99，1〕。
不論用于色氨酸合成的微生物是一個(gè)突變菌株還是轉(zhuǎn)化菌株，色氨酸都是通過下列途徑合成的圖表1
鄰氨基苯甲酸是在色氨酸生物合成途徑的第一個(gè)主要前體。生產(chǎn)色氨酸的最后一步是色氨酸合成酶參與了一個(gè)吲哚-3-磷酸甘油分子和一個(gè)絲氨酸分子縮合，成色氨酸和3-磷酸甘油醛。
人們發(fā)現(xiàn)，在微生物中通過吲哚-3-磷酸甘油集中起來的色氨酸前體庫是很多的。絲氨酸的供應(yīng)決定著色氨酸的生產(chǎn)率。一般絲氨酸生物合成是沿下列途徑進(jìn)行的。
圖表23-磷酸甘油酸3-磷酸羥基丙酮酸3-磷酸紅氨酸(葉酸)絲氨酸 甘氨酸L-絲氨酸脫水酶丙酮酸(L-絲氨酸脫氨酶)丙酮酸乙酰輔酶A絲氨酸在幾條途徑里被消耗。一條是絲氨酸通過四氫葉酸反應(yīng)轉(zhuǎn)化成甘氨酸。另一條主要降解途徑是L-絲氨酸脫氨酶作用于絲氨酸導(dǎo)致產(chǎn)生丙酮酸和乙酰輔酶A。在尿酸梭菌中，L-絲氨酸脫氨酶被認(rèn)為是尿酸發(fā)酵途徑的一種酶。該酶一般在一系列絲氨酸生成和它作為主要碳素代謝部分的進(jìn)一步代謝活動中起作用。L-絲氨酸脫氨酶的水平隨著氮素營養(yǎng)，碳源和氨基酸可利用程度而改變。L-絲氨酸脫氨酶活動的誘導(dǎo)物是很具特征性的。這些誘導(dǎo)物包括氮素的缺乏，甘氨酸和亮氨酸的存在(但不是絲氨酸，因?yàn)樗挥绊懜拾彼岷土涟彼岬恼T導(dǎo))，和在葡萄糖基本培養(yǎng)基上的生長。
在生產(chǎn)氨基酸最廉價(jià)的葡萄糖基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，L-絲氨酸脫氨酶的水平是高的。(參見紐曼(Newman F·B·)和卡普爾(Kapo-or·V·的文章“大腸桿菌K12菌株中L-絲氨酸脫氨酶活性的離體研究”刊載在加拿大生化雜志(Can·J·Biochem·)58期，1292-1297頁，(1980年)。據(jù)信它通過脫氨作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)絲氨酸水平的下降，保持絲氨酸庫處于低水平，避免了絲氨酸對L-蘇氨酸脫氨酶的抑制作用。(參見伊森伯格(Isenberg'S·)和紐曼(NewmanE·B·)的文章“大腸菌K12菌株中L-絲氨酸脫氨酶的研究”，載在細(xì)菌學(xué)雜志118期，53-58頁(1974年)?？梢钥隙ǖ氖窃谟蠰-絲氨酸脫氨酶存在時(shí)，大腸桿菌K12菌株不可逆地把L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸或者一個(gè)和丙酮酸處于同一氧化水平的化合物。既使L-絲氨酸脫氨酶的一個(gè)自然底物，它也能在生理上有意義的反應(yīng)中被L-絲氨酸脫氨酶降解(參見紐曼(Newman'E·B·)和沃克(Wa-lker'C·)文章“在大腸桿菌K12菌株中L-絲氨酸的降解L-絲氨酸，甘氨酸和亮氨酸聯(lián)合作為碳源”，刊載在細(xì)菌學(xué)雜志151期777-782頁(1982年)。
絲氨酸對色氨酸生物合成或絲氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的可利用性可以通過利用缺乏絲氨酸降解酶的微生物得到加強(qiáng)。葉酸鹽缺乏的微生物從代謝的觀點(diǎn)來看過于應(yīng)激反應(yīng)以致于在培養(yǎng)中不能繼續(xù)維持。然而，缺乏L-絲氨酸脫氨酶的微生物可以繼續(xù)培養(yǎng)，并用來，并用來作為加強(qiáng)色氨酸生物合成的微生物來源。
L-絲氨酸脫氨酶缺乏活性的微生物在色氨酸生產(chǎn)中的有用性特別是體現(xiàn)在那些被修飾為增強(qiáng)色氨酸生產(chǎn)的微生物。例如，一些在美國專利4，371，614中被揭示的微生物，其中用攜帶色氨酸生物合成信息的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的色氨酸酶活性缺乏的大腸桿菌K12菌株在生產(chǎn)色氨酸時(shí)就比未加修飾的大腸桿菌菌株產(chǎn)量高得多。在這些菌株中色氨酸生產(chǎn)的限制因子是L-絲氨酸的降解及是否通過微生物合成它或是否通過L-絲氨酸脫氨酶從外源來供應(yīng)它。
在美國專利4，371，164揭述的菌株及其它為增加色氨酸生產(chǎn)而修飾了的菌株可以通過在L-絲氨酸脫氨酶缺乏活性的菌株中生長的噬菌體P，用它轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生色氨酸的菌株，再篩選出降低L-絲氨酸脫氨酶活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體或增加色氨酸生產(chǎn)或二者兼有之的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株進(jìn)一步增加色氨酸的生產(chǎn)。
發(fā)明者制造和分離了一些微生物菌株，特別是革蘭氏陰性菌，像L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏或幾乎沒有的大腸桿菌。術(shù)語“L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏菌株”在此是指微生物中L-絲氨酸脫氨酶活性低于野生型親本的菌株。(L-絲氨酸脫氨酶活性的測定是用后面例子中描述的方法進(jìn)行的)。根據(jù)這個(gè)定義，L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏菌株中該酶活性在5個(gè)毫單位或更低(在后面的例子中確定)。L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏的大腸桿菌菌株不能在含絲氨酸，甘氨酸或亮氨酸的基質(zhì)上生長，當(dāng)它生長在葡萄糖基本培養(yǎng)基上缺乏L-絲氨酸脫氨酶的活性。根據(jù)本發(fā)明，大腸桿菌K12菌株暴露在紫外線照射或利用增變噬菌體Mu的dx轉(zhuǎn)座子(Mudx)插入到大腸桿菌K12菌株后的轉(zhuǎn)座子諉變再適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上篩選出缺乏L-絲氨酸脫氨酶的突變菌株。
根據(jù)發(fā)明所敘述的程序提供了一個(gè)從廣泛可利用的微生物中制造和分離缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株的方法。這些可以利用的微生物包括革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。
圖Ⅰ是一個(gè)表示不同氨基酸的不同濃度與181-34菌株產(chǎn)量關(guān)系的曲線圖。
圖Ⅱ是質(zhì)粒PD2643內(nèi)切酶切點(diǎn)圖解。
從下面例子我們可以更好地理解發(fā)明。
例Ⅰ1、MEW128菌株的分離一個(gè)在ilva部分缺失的野生型大腸桿菌CU1008菌株是從美國密蘇里州圣路易斯市華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院威廉斯先生(L·S·Wi-lliams)處得到的。
MEW 128菌株用紫外光照射CU1008菌株，再根據(jù)戴維斯(Davis'B·D·)等人的方法在含青霉素并含絲氨酸2毫克/毫升，甘氨酸200微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的葡萄糖培養(yǎng)基上在37℃下繼代培養(yǎng)。(參見“用青霉素分離生化缺陷型細(xì)菌”，刊在美國化學(xué)協(xié)會雜志70卷4267頁(1948)。把殘存者轉(zhuǎn)移到葡萄糖基本培養(yǎng)基，用影印法篩選并在添加了如上配方中含量的絲氨酸，甘氨酸、和亮氨酸的細(xì)菌甲瓊脂(Bacto-Agar)培養(yǎng)基上培養(yǎng)(稱之為SGL-平板培養(yǎng)基)。MEW128菌株由于不能在SGL-平板上生長，也不能在液體的葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長而被選擇了。這個(gè)菌株也是需要硫胺素的，它已被貯存在美國樣品培養(yǎng)收集中心(ATCC)。該中心的地址是美國，馬里蘭州，羅克威爾，帕克龍-德策伏12301，Parklawn，Drive，Rockvill，Maryland，U·S·A·20852)登記號為39577。登記時(shí)間為1984年1月12日。
盡管MEW128菌株初步分離已如上述進(jìn)行了，它還需要進(jìn)一步通過在葡萄糖基本培養(yǎng)基追加其它物質(zhì)的培養(yǎng)基上用影印法篩選。如上述加絲氨酸、甘氨酸和亮氨酸，再加8克/升的捷特利特(一種凝固劑的商品名Gelrite商標(biāo)為Kelco 63002A)，使培養(yǎng)液凝固成平板。再加硫胺素10毫升/升，氯化鐵5毫克/升，鉬酸鈉0.1毫克/升，氯化錳0.12毫克/升。
MEW 128菌株不能在這種培養(yǎng)基上生長。
2、酶試驗(yàn)L-絲氨酸脫氨酶活性試驗(yàn)是用伊森伯格(Lsenberg'S·)和紐曼(Newman'E·B·)所述的方法，用甲苯處理了的完整細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。見“大腸桿菌K12菌株L-絲氨酸脫氨酶的研究?！陛d在細(xì)菌學(xué)雜志118期，53-58頁(1974年)，它已被列在參考文獻(xiàn)中。結(jié)果在下面的表1，單位是毫單位(mu)，也就是0.1毫升含100Klette單位的細(xì)胞懸液在35分鐘產(chǎn)生的酮酸的毫微克分子數(shù)。在這個(gè)試驗(yàn)中5毫單位是最低的可靠值。
表1L-絲氨酸脫氨酶在MEW128菌株及其它相關(guān)菌株中的活性其它相關(guān)菌株中的活性 不依賴硫胺試驗(yàn)號 培養(yǎng)條件 CU1008 MEW128 素的回復(fù)體1 葡萄糖基本培養(yǎng)基 19 5 72 加甘氨酸和亮氨酸 110 5 313 紫外線照射 130 5 384 42℃ 34 5 255 LB培養(yǎng)基 230 30 51＊LB培養(yǎng)基含有細(xì)菌用胰化蛋白(.Bactryptone是其商品名)10克/升，細(xì)菌用酵母提取物5克/升，氯化鈉10克/升(參見米勒Miller，J·H·著的“分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)”，冷泉港(1973年)，下面將提及米勒。)把37℃下在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長的對數(shù)生長期細(xì)胞在下面五種條件下繼代培養(yǎng)與上面一樣的培養(yǎng)基，37℃(實(shí)驗(yàn)1)和42℃下實(shí)驗(yàn)4);與上面一樣的培養(yǎng)基加上一些氨基酸(實(shí)驗(yàn)2);在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)5);把一些細(xì)胞先用紫外光照射60秒后再葡萄糖基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)3)。沒特殊說明的均是在37℃下恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)后1小時(shí)測定L-絲氨酸脫氨酶的活性。實(shí)驗(yàn)方法的細(xì)節(jié)在紐曼(Newman'E·B·)等人的文章“用把大腸桿菌K12菌株暴露于DNA損傷劑的方法所誘導(dǎo)的L-絲氨酸脫氨酶的活性”中已敘述。該文刊在細(xì)菌學(xué)雜志152期，702-705頁(1982年)。
3氧MEW128的特征①生長要求MEW128菌株不能在添加上述濃度的絲氨酸、甘氨酸和亮氨酸的葡萄糖基本平板培養(yǎng)基上生長。葡萄糖基本培養(yǎng)基支持MEW128生長;但是液體葡萄糖培養(yǎng)基不行，除非添加1/200(體積/體積)的LB培養(yǎng)基。硫胺素3微克/升能代替對LB培養(yǎng)基的需要。對硫胺素的需要可以通過在每個(gè)液體葡萄糖培養(yǎng)基里添加超過300微克/毫升的琥珀酸和醋酸或5微克/毫升的賴氨酸和10微克/毫升的蛋氨酸來代替。真正依賴硫胺素的菌株缺乏乳酸脫氫酶(LDH)，因?yàn)檫@種酶需要硫胺素做為輔助因子。這樣，依賴硫胺素的微生物菌株分泌丙酮酸。MEW 128分泌丙酮酸可以通過非酸化的培養(yǎng)物上清液和商品乳酸脫氫酶(伯林格-曼海姆公司出品，Boehringer Mannheim Co·)反應(yīng)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化實(shí)驗(yàn)來鑒定。(參見霍浩斯特Hohorst'H·-J·的文章“用乳酸脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸鑒定L-(+)乳酸”，刊在酶學(xué)分析方法(于1965年學(xué)院出版公司出版，第二版，編者是伯格姆耶(Bergmya'H·V·)和沃策格，舍米(Vellag Chemi)。結(jié)果表明本質(zhì)上所有的酮酸都是丙酮酸。
②L-絲氨酸脫氨酶活性實(shí)驗(yàn)表明37℃，在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長的MEW 128菌株很少(僅5毫單位)或沒有L-絲氨酸脫氨酶活性(表1)。然而在LB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物誘導(dǎo)出實(shí)在量的活性(30毫單位)，大大低于在同樣條件下生長的親本菌株的活性(230毫單位)。其它已知的L-絲氨酸脫氨酶誘導(dǎo)物-紫外光、甘氨酸和亮氨酸以及增加溫度(42℃)都沒發(fā)生有意義的效應(yīng)。(都差不多只有5個(gè)毫單位)。很明顯，MEW 128菌株雖然對大多數(shù)常規(guī)誘導(dǎo)條件無反應(yīng)，它卻保留了產(chǎn)生一些L-絲氨酸脫氨酶活性的能力。
用生長在加硫胺素的葡萄糖基本培養(yǎng)基上的細(xì)胞重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相同。添加過量的硫胺素是不能恢復(fù)L-絲氨酸脫氨酶的活性。為了保證硫胺素在正常情況下不影響L-絲氨酸脫氨酶的活性?？梢钥隙ǎ虬匪卦谡Ｇ闆r下不影響L-絲氨酸脫氨酶的活性。按上述方法測定了在添加或不加硫胺素條件下生長的親本CU1008菌株細(xì)胞內(nèi)L-絲氨酸脫氨酸脫氨酶的活性?？梢钥吹?，活性沒有不同。(資料未給)。
總之，MEW 128菌株在兩個(gè)方面與親本不同它生長需要硫胺素;既使在誘導(dǎo)L-絲氨酸脫氨酶的條件下，它也缺乏這個(gè)酶的活性。
③不依賴硫胺素的MEW128回復(fù)體沒有硫胺素就可以在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長的MEW128的回復(fù)體被分離出來。它的單菌落分離物被接種到液體葡萄糖基本培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)到生長盛期。通過把液體培養(yǎng)物涂于葡萄糖基本培養(yǎng)基平板來分離菌落。因?yàn)镸EW 128生長在葡萄糖基本培養(yǎng)基平板上，所以很明顯，液體培養(yǎng)基僅僅是為了選擇不依賴硫胺素的菌株。
用上述方法在葡萄糖基本培養(yǎng)基上測定同時(shí)分離出的不依賴硫胺素的二十五個(gè)菌種的L-絲氨酸脫氨酶活性。結(jié)果表明都顯示有些活性。這些菌株中的五個(gè)在葡萄糖基本培養(yǎng)基和添加了甘氨酸250微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的基本培養(yǎng)基上測定其L-絲氨酸脫氨酶活性。該酶在沒誘導(dǎo)時(shí)其值為9-18毫單位，誘導(dǎo)時(shí)為27-47毫單位。從未見過恢復(fù)到野生型的水平。一種回復(fù)體在各種誘導(dǎo)條件下測定的值示在表1。在所有情況下只觀察到了部分誘導(dǎo)。
例Ⅱ1、MEW 191菌株的分離攜帶一個(gè)乳糖操縱子缺失的CU 1008菌株的衍生體(后面稱為CU1008△lac)，通過用青霉素選擇分離出的脯氨酸營養(yǎng)缺陷型，然后用一個(gè)攜帶乳糖操縱子缺失的給體轉(zhuǎn)導(dǎo)成不需脯氨酸的菌株。給體菌株CAG5050(MudxCAM(APr lac)Pro lac his met rpsl nalr/FPro lac Z8305∶∶Mu Cts62)是從美國威斯康星、麥迪遜，威斯康星大學(xué)的豪(M·Howe)那里得到的。這個(gè)菌株對MudlB∶∶Tng噬菌體-一個(gè)Mndl噬菌株的X突變體是溶源性的。(見卡薩達(dá)班Casadaban，M·J·和科恩cohen'S·N·的文章“一個(gè)Mu-lac噬菌體一步將乳糖基因融合到外源啟動子體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄控制順序的探釬”，刊在美國科學(xué)院學(xué)報(bào)76卷4530-4533頁(1979年)。Mudl噬菌體X突變體是通過把轉(zhuǎn)座子9(Tng)插入到B基因而得到的。(參見貝克Baker，T·A·等人的文章“Mudx，一種在高溫下使lacZ穩(wěn)定融合的Mudl(lacAPr)衍生體”，刊載在細(xì)菌學(xué)雜志156期，970-974頁(1983年)。)CU1008△lac菌株用在高溫下穩(wěn)定與lacZ融合的噬菌體Mudx轉(zhuǎn)導(dǎo)為抗氯霉素和抗氨芐青霉素菌體。轉(zhuǎn)導(dǎo)了的菌株被稱作MEW191，它是被分離出的抗氨芐青霉素和氯霉素菌株，不能在SGL一平板上生長。這個(gè)菌株在1984年1月12日已貯存在美國樣品培養(yǎng)收集中心，登記號為35575。
2、酶方法在例1中用的同樣方法被用在例2。
3、MEW191菌株的特征記述生長需要MEW191菌株是抗氯霉素和抗氨芐青霉素的，它不能在含絲氨酸，甘氨酸和亮氨酸培養(yǎng)基上生長，而且與MEW128菌株表現(xiàn)型一樣需要硫胺素，在葡萄糖基本培養(yǎng)基上幾乎沒有L-絲氨酸脫氨酶活性，改變了的對誘導(dǎo)物的反應(yīng)(見表Ⅱ)，MEW191菌株的L-絲氨酸脫氨酶活性實(shí)際上是與MEW128相似的。這個(gè)菌株也是在缺乏硫胺素時(shí)分泌丙酮酸。
表ⅡMEW191及有關(guān)菌株的L-絲氨酸脫氨酶的活性恒溫培養(yǎng) MEW191 回復(fù)體1 1 3葡萄糖基本培養(yǎng)基 5 23 15 12加甘氨酸和亮氨酸 5 101 50 46紫外線照射 5 103 nd nd42℃ 5 37 nd ndLB培養(yǎng)基 12 173 nd nd＊nd＝?jīng)]有測定4、不依賴硫胺素的MEW191回復(fù)體分離出了能夠在具有絲氨酸、甘氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上生長的MEW 191回復(fù)體。它們當(dāng)中一些是抗氯霉素的和抗氨芐青霉素的，另一些則不具抗性。進(jìn)一步測定了四個(gè)對抗生素敏感的菌落，證實(shí)它們是不依賴硫胺素的，而其L-絲氨酸脫氨酶活性水平與親本菌株相似。在有甘氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物誘導(dǎo)出較高的L-絲氨酸脫氨酸活性，但不如CU1008菌株那么高。
例Ⅲ1、一個(gè)缺失L-絲氨酸脫氨酶，不需要硫胺素的IK15-5菌株的分離采用與例Ⅱ同樣的方法和相同的親本菌株CU1008△lac來分離例Ⅲ的，不能在SGL-平板培養(yǎng)基上生長的IK15菌株。應(yīng)用常規(guī)的噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(見米勒Miller)，用生長在IK15菌株中的噬體P1把CU 1008△lac菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)為抗氨芐青霉素和抗氯霉素的菌株。IK15-5菌株作為CU1008△lac的轉(zhuǎn)導(dǎo)體被分離出來。它幾乎沒有L-絲氨酸脫氨酶的活性，抗氨芐青霉素和氯霉素，不能在SGL平板上生長。這個(gè)菌株1984年1月12日已被貯存在美國樣品培養(yǎng)收集中心，登記號為39576。
2、酶方法例Ⅲ用和例Ⅰ同樣的方法。
3、IK15-5菌株的特征記述①生長要求菌株IK15-5是抗氯霉素和抗氨芐青霉素的，不能在SGL-平板上生長。更有意義的是，IK 15-5不需要硫胺素。
②L-絲氨酸脫氨酶活性IK15-5在葡萄糖基本培養(yǎng)基上是沒有L-絲氨酸脫氨酶活性的。在表Ⅲ所示的誘導(dǎo)條件下改變該酶的活性。IK15-5菌株中L-絲氨酸脫氨酶活性實(shí)際上與在MEW128菌株很相似。生長和測定條件都與例Ⅰ，表Ⅰ相同。
表Ⅲ培養(yǎng)條件 L-絲氨酸脫氨酶在IK15-5菌株中活性(毫單位)葡萄糖基本培養(yǎng)基 2加甘氨酸和亮氨酸 9紫外光照射 342℃ 4LB培養(yǎng)基 75例Ⅳ各菌株中顯示降低L-絲氨酸脫氨酶活性的遺傳缺陷的特征記述1、L-絲氨酸脫氨酶結(jié)構(gòu)基因缺陷如米勒(Miller)描述的方法，用插入到IK15-5菌株中突變基因來研究β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)錄表明插入是發(fā)生在L-絲氨酸脫氨酶的結(jié)構(gòu)基因。如表Ⅳ所示，這種菌株在已知的誘導(dǎo)條件下與親本菌株比較，雖然L-絲氨酸脫氨酶活性沒有有意義的增加，但β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)錄卻增加了。生長與試驗(yàn)條件與例Ⅲ相同。
表ⅣL-絲氨酸脫氨酶 β-半乳糖苷酶 L-絲氨酸脫氨酶條件 活性(單位/毫克蛋白質(zhì)) 活性(毫單位)葡萄糖基本培養(yǎng)基 60 2加甘氨酸和亮氨酸 122 9紫外光照射 99 342℃ 57 4LB培養(yǎng)基 225 75來自IK15-5菌株突變基因的插入，β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)錄，由于一個(gè)已知增加了L-絲氨酸脫氨酶活性的突變而增加了。
野生型大腸桿菌K12菌株中的ssd突變是一個(gè)多效性的基因突變。它的最明顯的效應(yīng)是L-絲氨酸脫氨酶活性表達(dá)的增加和如莫里斯(Mo-rris，J·F)和紐曼(Newman，E·B·)所述的不能利用琥珀酸鹽作為碳源。參見“大腸桿菌K12中ssd突變的定位圖”刊在細(xì)菌學(xué)雜志，143期，1504-1505頁(1980年)。分離ssd突變的方法在紐曼(Newman，E·B·)等人的文章“大腸桿菌K12中L-絲氨酸的降解直接分離ssd突變體和它們的基因內(nèi)回復(fù)子”中已敘述(刊在細(xì)菌學(xué)雜志150期710-715頁(1982年))。
CU1008菌株中的ssd突變體通過它們能在含L-絲氨酸2毫克/毫升的培養(yǎng)基中生長被分離出來。用常規(guī)技術(shù)通過P1噬菌體把ssd突變體轉(zhuǎn)導(dǎo)到CU1008met B-受體，選擇不依賴蛋氨酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株，再篩選出能利用L-絲氨酸生長的那些菌落。把其中一個(gè)稱作CU1008 ssd的菌株用生長在IK15-5菌株上的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)。不能在絲氨酸、甘氨酸、亮氨酸上生長及不依賴蛋氨酸的抗氯霉素和氨芐青霉素的菌落已被分離出來了。具有這種表現(xiàn)型又不能利用琥珀酸鹽為碳源的菌株被命名為IK/ssd菌株。
按前述方法測定IK/ssd菌株中β-半乳糖酶的活性，其活性比ssd/IK菌株高3倍，但L-絲氨酸脫氨酶活性沒有有效的增加。在IK/ssd和IK15-菌株中，L-絲氨酸脫氨酶和β-半乳糖酶活性的比較結(jié)果見表Ⅴ。其結(jié)果表明了ssd影響位于IK15衍生體的L-絲氨酸脫氨酶結(jié)構(gòu)基因中的β-半乳糖酶順序轉(zhuǎn)錄的增加。
表ⅤIK/ssd菌株 IK15-5菌株L-絲氨酸脫酶 β-半乳糖甘 L-絲氨酸 β-半乳糖 L-絲氨誘導(dǎo)條件 酶活性(單位/ 脫氨酶活性 酶活性(單 酸脫氨毫克蛋白質(zhì)) (毫單位) 位/毫克蛋 酶活性白) (毫單位)葡萄糖基本培養(yǎng)基 179 1 60 2加甘氨酸和亮氨酸 225 4 122 9LB培養(yǎng)基 645 53 225 752、影響L-絲氨酸脫氨酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的MEW128菌株調(diào)節(jié)基因的缺陷在MEW128發(fā)現(xiàn)的含有幾種突變的雙突變體和在IK15菌株發(fā)現(xiàn)的某種突變的雙突變體被用下列方法分離出來按常規(guī)技術(shù)，用生長在IK-15菌株的噬菌體P1把CU1008菌株的Mu噬菌體溶源性菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)為抗氯霉素和氨芐青霉素的菌株。一株對上述抗生素有抗性的，通過不能在SGL一平板上生長而確定其缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的Mu噬菌體溶源菌株被分離出來，命名為IK15-3。按常規(guī)的技術(shù)，用生長在IK15-3的噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)MEW128。一株被命名為128/IK15-3的菌株已分離出，它具有抗生素抗性，通過不能在SGL一平板上生長鑒定其缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性，它生長時(shí)需要硫胺素。
用上述方法在L-絲氨酸脫氨酶誘導(dǎo)條件下測定了128/IK15-3菌株中β-半乳糖苷酶和L-絲氨酸脫氨酶的活性。同樣條件下也測定了IK15-3。表Ⅳ中的結(jié)果表明來自IK15-3的啟動的β-半乳糖酶的轉(zhuǎn)錄在攜帶MEW 128突變的菌株中被抑制，MEW128突變的菌株中被抑制，MEW128突變是發(fā)生在調(diào)節(jié)基因中，因此阻止了L-絲氨酸脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。
表Ⅳβ-半乳糖苷酶 L-絲氨酸脫氨酶活性L-絲氨酸脫氨酶 活性(單位/毫克蛋白質(zhì)) (毫單位)培養(yǎng)條件 IK15-3 128/IK15-3 128/IK15-3葡萄糖基本培養(yǎng)基 44 不能察覺 2 1加甘氨酸和亮氨酸 150 不能察覺 13 4LB培養(yǎng)基 225 不能察覺 75 50例Ⅴ用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的大腸桿菌減少絲氨酸的降解1、缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的絲氨酸和(或)甘氨酸營養(yǎng)缺陷型限制生長時(shí)利用絲氨酸的效應(yīng)三個(gè)在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長時(shí)需要絲氨酸或甘氨酸的營養(yǎng)缺陷型已從CU1008△lac菌株分離出來。其中兩個(gè)是如例Ⅱ中描述的，用Mudx插入突變方法分離的。營養(yǎng)缺陷型是通過對絲氨酸的需要來篩選。兩個(gè)被命名為181-34的營養(yǎng)缺陷型是用大腸桿菌的Mal103菌株的溶菌物作為給體從CU1008△lac制造的，它的主要基因是F-，Mudl(APrlac)ara B∶∶MuCts，araD139，△(lac IPOZYA)U169，StrA。這個(gè)菌株是從美國紐約州紐約市紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院的麥克福爾處得到的。(E·McFall，New York Uni-versity，Schod of Medicine，New York，New York，U·S·A·)181-34菌株是通過對氨芐青霉素有抗性來選擇，再通過對絲氨酸需要進(jìn)一步篩選的。
按常規(guī)技術(shù)，用生長在DR1，DR4和181-34菌株上的噬菌體P1把MEW 128菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)為抗生素抗性的菌株。具有抗性的不能以甘氨酸和亮氨酸為碳源生長的絲氨酸和(或)甘氨酸營養(yǎng)缺陷型的雙突變體已被鑒定并命名為128/DR1，128/DR4和128/181-34。
三個(gè)營養(yǎng)缺陷型菌株DR1，DR4和181-34以及三個(gè)雙突變體128/DR1 128/DR4和128/181-34在添加了L-絲氨酸300微克/毫升的葡萄糖含(2毫克/毫升)基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(這個(gè)絲氨酸量予先測定是不能滿足絲氨酸營養(yǎng)缺陷型生長的需要的。)少量地接種這六個(gè)菌株的培養(yǎng)物在這個(gè)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)到靜止期，搖勻后用比色計(jì)測定，每個(gè)菌株最后產(chǎn)量用毫克蛋白質(zhì)/毫升培養(yǎng)液為單位來測量，(勞里法測定Lowrydetermination)。每個(gè)菌株也按前述方法測定L-絲氨酸脫氨酶活性。如表Ⅶ所示，在所有情況下絲氨酸(或甘氨酸)缺陷和缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的雙突變都比相應(yīng)的絲氨酸(或甘氨酸)營養(yǎng)缺陷型中產(chǎn)量。
表Ⅶ菌株 L-絲氨酸脫氨酶活性(毫單位) 產(chǎn)量(微克蛋白質(zhì)/毫升培養(yǎng)液)DR1 90 30128/DR1 6 38DR4 未測 31128/DR4 6 40181-34 96 27128/181-34 5 462、有限的絲氨酸的利用對在L-絲氨酸脫氨酶誘導(dǎo)條件下大腸桿菌絲氨酸(或甘氨酸)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的影響
絲氨酸(或甘氨酸)營養(yǎng)缺陷型但不缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的181-34菌株在予先測定的該酶誘導(dǎo)條件下用有限的絲氨酸(300微克/毫升培養(yǎng)液)培養(yǎng)，在靜止期測量181-34菌株，其產(chǎn)量(以微克蛋白質(zhì)/毫升培養(yǎng)液)表示在表Ⅶ中。
表Ⅶ生長條件 產(chǎn)量(微克蛋白質(zhì)/毫升培養(yǎng)液)葡萄糖基本培養(yǎng)基+絲氨酸 37(300微克/毫升)，37℃下葡萄糖基本培養(yǎng)基+絲氨酸300微克/毫升)+亮氨酸(50微克/毫升)，37℃ 16下葡萄糖基本培養(yǎng)基+絲氨酸(300微克/毫升) 1942℃3、外源絲氨酸濃度的增加對絲氨酸(或甘氨酸)營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌產(chǎn)量的影響把181-34菌株分幾份少量地接種地葡萄糖基本培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中增加外源絲氨酸的濃度，并如前述在靜止期測定其產(chǎn)量。為了比較，同樣菌株在同樣條件下培養(yǎng)，只是有一組增加甘氨酸濃度。其結(jié)果在表Ⅸ及圖Ⅰ中所示。其菌株最后生長量不是與絲氨酸或甘氨酸的起始濃度成線性關(guān)系。然而，在大約高于甘氨酸200微克/毫升時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。但實(shí)驗(yàn)用絲氨酸時(shí)任何濃度其產(chǎn)量都沒達(dá)到相應(yīng)的平穩(wěn)狀態(tài)。絲氨酸沒有產(chǎn)量平穩(wěn)狀態(tài)表明起始絲氨酸即使在高濃度下，依然是限制生長的。說明在產(chǎn)生L-絲氨酸脫氨酶的大腸桿菌生長時(shí)，絲氨酸被消耗于限制生長的濃度。
表Ⅸ181-34菌株氨基酸的濃度 產(chǎn)量(毫克蛋白質(zhì)/毫升含 產(chǎn)量(毫克蛋白質(zhì)/毫(微克/毫升) 絲氨酸的培養(yǎng)基) 升含甘氨酸培養(yǎng)基)0 0 050 40 140100 70 192200 135 250250 166 260300 179 280400 211 250500 230 260600 245 260900 300 2801000 300 沒測例Ⅷ利用L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏型大腸桿菌建立色氨酸高產(chǎn)菌株1、C534菌株的建立B1238菌株是一種大腸桿菌菌株(從美國加利福尼亞州帕洛阿爾托斯坦福大學(xué)，坎貝爾實(shí)驗(yàn)得到的。)它需要乳糖，生物素和色氨酸(Cal-Bio，TrP。)B1238GB菌株是B1238的轉(zhuǎn)導(dǎo)體，能制造乳糖和生物素的P1噬菌體(Gal+，Bio+，P1)把給體菌株W3110轉(zhuǎn)導(dǎo)到B1238構(gòu)成的。而菌株A103是一個(gè)甲基磺酸乙酯(EMS)突變后選擇的B1238GB的抗鄰氨基苯甲酸的衍生菌株。菌株C534是用生長在給體C537菌株上的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)Sal+Tna-(色氨酸陰性)基因到A103菌株而得到的。
2、C534SD菌株的建立生長在L-絲氨酸脫氨酶陰性的菌株MEW191上面的P1噬菌體可以用來轉(zhuǎn)導(dǎo)C534菌株成為抗氨芐青霉素和抗氯霉素(APr，Cmr)其中一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)體被稱為C534SD。不象C534菌株，C534SD菌株在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長沒有L-絲氨酸脫氨酶活性，而且它需要硫胺素。
3、C534和534SD攜帶質(zhì)粒的衍生菌株的建立質(zhì)粒PD2643是大腸桿菌中攜帶與色氨酸合成有關(guān)的trpA，trpB trPC，和trPD基因及抗四環(huán)素的質(zhì)粒PBR322的衍生質(zhì)粒。(見圖Ⅱ)這個(gè)質(zhì)粒如前所述可以被引進(jìn)C534菌株，也可以被引進(jìn)C534SD菌株。使它們轉(zhuǎn)化為抗四環(huán)素(Tcr)菌株。C534(PD2643)和C534SD PD2643)都是具有代表的轉(zhuǎn)化體。
4、通過C534(PD2643)和C534SD(PD2643)菌株把鄰氨基苯甲酸發(fā)酵成色氨酸把這些菌株培養(yǎng)在含20毫升的添加了葡萄糖2.0%，酪蛋白水解產(chǎn)物0.4%(NZ-amine)，硫胺素1微克/毫升，四環(huán)素20微克/毫升和鄰氨基苯甲酸1000微克/毫升的瓦格爾一包納基本培養(yǎng)基(Vogel-Bonner)，置于250毫升的搖瓶中。再放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，以280轉(zhuǎn)/分的速度在30℃下震蕩培養(yǎng)。
從搖瓶中定時(shí)取樣，用標(biāo)定了標(biāo)準(zhǔn)液測定色氨酸和的濃度。C534SD PD2643)中色氨酸產(chǎn)量始終超過C534(PD2643)的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是利用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所用的突變菌株是幾乎沒有L-絲氨酸脫氨酶活性的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征是其中的結(jié)構(gòu)基因突變是一個(gè)插入突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征是其中的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx·(Mudx CAM(APrlac)
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征是其中的調(diào)節(jié)基因突變是一個(gè)插入突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征是其中的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlan)
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所用的突變菌株含有一個(gè)與L-絲氨酸脫氨酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變和一個(gè)與該酶活性有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述方法，其特征是其中所說的與L-絲氨酸脫氨酶有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因突變是一個(gè)插入突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述方法，其特征是其中所說的結(jié)構(gòu)基因的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlac))。
12.根據(jù)權(quán)利要求
9所述方法，其特征是其中所說的與L-絲氨酸脫氨酶有關(guān)的調(diào)節(jié)基因突變是一個(gè)插入突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求
9所述方法，其特征是其中所說的調(diào)節(jié)基因的插入突變是插入了抗氯霉素和氨芐青霉素的噬菌體Mudx(Mudx CAM(APrlac))。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，其特征是其中所用的突變菌株是屬于大腸桿菌的一些種(Escherichia Coli)。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述方法，其特征是其中所用的大腸桿菌是K12菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，其特征是其中所用的菌株是需要硫胺素的菌株。
17.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是所用的突變菌株具有MEW128菌株的L-絲氨酸脫氨酶的活性特點(diǎn)，它已于1984年1月12日被貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號是39539577。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述方法，其特征是其中所用的突變菌株是屬于大腸桿菌的一些種。(Escherichia Coli)。
19.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是所用的突變菌株具有MEW191菌株的L-絲氨酸脫氨酶活性特點(diǎn)，它已于1984年1月12日被貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號是39577。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19所述方法，其特征是其中所用的突變菌株是屬大腸桿菌的一些種(Escherichia＃Coli)。
21.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是所用的突變菌株具有IK15-5菌株的L-絲氨酸脫氨酶的活性特點(diǎn)，它已于1984年1月12日被貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號為39576。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21所述方法，其特征是其中所用的突變菌株是屬于大腸桿菌的一些種。(Escherichia＃Coli)。
23.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是其中所用的突變菌株是大腸桿菌(E·Coli)MEW128菌株，它已于1984年1月12日被貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號為39577。
24.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是其中所用的突變菌株是大腸桿菌(E·Coli)MEW191菌株，它已于1984年1月12日貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號為39575。
25.一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征是其中所用的突變菌株是大腸桿菌(E·Coli)IK15-5菌株。它已于1984年1月12日貯存在美國培養(yǎng)物樣板收集中心(ATCC)，登記號為39576。
26.一種生產(chǎn)L-色氨酸的突變菌株，其特征是它的L-絲氨酸脫氨酶缺乏活性。
27.L-色氨酸，其特征是通過利用L-絲氨酸脫氨酶活性缺乏的菌株生產(chǎn)出來的。
專利摘要
本發(fā)明敘述了用缺乏L-絲氨酸脫氨酶活性的突變菌株，特別是從廣泛可利用的親本微生物如大腸桿菌，得到的這種突變菌株生產(chǎn)色氨酸的方法。
文檔編號C12P13/22GK85101270SQ85101270
公開日1987年1月17日 申請日期1985年4月1日
發(fā)明者伊萊恩·紐曼 申請人:斯托弗化學(xué)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan