一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑，所述注射劑包含0.05mg/ml～30mg/ml的絲氨酸蛋白酶抑制劑Recombinant textilinin-1和pH緩沖劑、表面活性劑、多元醇、氨基酸和抑菌劑。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶抑制劑注射劑提高了蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性，并且制備工藝簡(jiǎn)單，抗纖溶治療效果好，可用于臨床，治療和預(yù)防各種原因?qū)е碌睦w溶亢進(jìn)出血、失血。
【專利說明】
-種竺氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑。
【背景技術(shù)】
[0002] Textilinin-1 是從澳大利亞棟蛇 Pseudonaja textilis textilis 中提取的一種 活性蛋白。Textilinin-1屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，含有59個(gè)氨基酸，3對(duì)二硫 鍵，分子量約為6. 7kDa。本發(fā)明使用的Recombinant textilinin-1是W畢氏酵母為表達(dá)體 系獲得的Textilinin-1的重組蛋白。
[0003] 絲氨酸蛋白酶抑制劑廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物體中，能對(duì)蛋白酶活性進(jìn)行精 確調(diào)控。牛膜蛋白酶抑制劑度PTI)作為首次發(fā)現(xiàn)的Kunitz型蛋白酶抑制分子，是該蛋白 家族中的經(jīng)典代表。Aprotinin是從牛肺中提取的與BPTI有相同序列的蛋白，是止血藥抑 膚酶注射劑的主要成分。可用于治療和預(yù)防各種纖維蛋白溶解所引起的急性出血及彌漫性 血管內(nèi)凝血。但在2007年12月，根據(jù)國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中屯、報(bào)告的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，抑 膚酶注射劑可引起過敏、休克、屯、惇、胸悶、呼吸困難、發(fā)熱、嘔吐等，因此退市。
[0004] 經(jīng)酶動(dòng)力學(xué)研究表明，Textilinin-1對(duì)纖溶酶（plasmin)和膜蛋白酶（付ypsin) 有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)kallikrein有較弱的抑制作用，對(duì)t虹ombin、factor Xa、u;rokinase 和t-PA沒有抑制作用。而抑膚酶（aprotinin)對(duì)纖溶酶、kallikrein和膜蛋白酶均有很 強(qiáng)的抑制作用，對(duì)化ctor Xa、尿激酶（urokinase)和t-PA有不同程度的抑制作用。并且 被textilinin-1抑制的纖溶酶將很快地被逆轉(zhuǎn)，比抑膚酶更容易控制，可降低因過度抑制 纖溶酶造成的血栓風(fēng)險(xiǎn)。Textilinin-1比抑膚酶對(duì)絲氨酸蛋白酶系抑制有更好的專一性與 特異性，及對(duì)纖溶酶有更好的逆轉(zhuǎn)性，因此能夠更好的監(jiān)測(cè)與控制Textilinin-1在血液中 對(duì)復(fù)雜成分的作用，及Textilinin-1對(duì)由纖溶酶引起的血漿和損傷部位的出血的抑制作 用。因此，在治療纖溶亢進(jìn)、出血及血管損傷中，尤其是原發(fā)性纖維蛋白溶解過渡所引起的 出血，Textilinin-1有望替代抑膚酶成為更安全可靠的止血藥。另外，Textilinin-1對(duì)膜 蛋白酶也有很強(qiáng)的抑制作用，故也可用于治療與預(yù)防各型膜腺炎。 陽0化]蛋白質(zhì)類藥物容易受到外界環(huán)境的影響產(chǎn)生物理和化學(xué)變化，物理變化主要包 括：蛋白質(zhì)Ξ級(jí)結(jié)構(gòu)的變化、共價(jià)及非共價(jià)鍵結(jié)合、單體附著等，運(yùn)些變化主要是由周圍環(huán) 境如溶劑等引起蛋白表面疏水區(qū)域的變化，電荷分布的變化及熱穩(wěn)定性的變化；化學(xué)變化 主要包括：二聚物分離、氧化、脫酷胺基作用、異構(gòu)化聚合等，引起運(yùn)些變化的原因主要是 鹽、抑和溫度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的藥物注射劑，該注射劑有效地解決了 蛋白質(zhì)類藥物成分Recombinant Textilinin-1的穩(wěn)定性問題，避免了蛋白質(zhì)類藥物成分 Recombinant Textilinin-1由于鹽、pH和溫度的影響而導(dǎo)致地物理變化和化學(xué)變化。
[0007] 本發(fā)明所述的 Recombinant textilinin-1 的氨基酸序列為：SEQ NO 1:邸RPDFCE LPADTGPCRVRFPSFYYNPDE 邸化邸 lYGGCEGNANNF口邸 ECESTCAA。
[0008] 本發(fā)明提供了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑，其包含0. 05mg/ml~30mg/ml 的絲氨酸蛋白酶抑制劑Recombinant Textilinin-1和抑緩沖劑、表面活性劑、多元醇、氨 基酸和抑菌劑。
[0009] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑緩沖劑為抑7. 2~7. 8的Tris-HCl或 pH 7. 0~7. 4的憐酸鹽緩沖液；優(yōu)選地，所述抑緩沖劑濃度為50mmol/L ;更優(yōu)選地，所述 pH緩沖劑為抑7. 4的Tris-肥1或抑7. 0的胞2冊(cè)0廣化&?〇4緩沖液。
[0010] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面活性劑為聚山梨醋80或聚山梨醋20， 所述表面活性劑的含量為Img/ml的Recombinant Textilinin-1對(duì)應(yīng)的表面活性劑的濃度 為 0. 1 ~1. 5mg/ml。
[0011] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多元醇選自甘油、甘露醇、山梨醇或聚乙二 醇中的一種或多種，優(yōu)選為山梨醇。所述多元醇的濃度為20~50mg/ml。
[0012] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸濃度為5~30mmol/l，所述氨基酸 選自甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸中的一種或多種，優(yōu)選由賴氨酸、 甘氨酸和甲硫氨酸組成；所述氨基酸的總濃度為5~30mmol/l，優(yōu)選地，所述的氨基酸的 總濃度為25mmol/L ;更優(yōu)選地，所述的氨基酸中賴氨酸的濃度為lOmmol/l，甘氨酸濃度為 5mmol/X，甲硫氨酸的濃度為lOmmol/L。
[0013] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑菌劑濃度為1. 5~30mg/ml，所述抑菌劑 選自Ξ氯叔下醇、苯酪、苯甲醇和間甲酪中的一種或多種。
[0014] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述注射劑還包含濃度為50mmol/L的可溶性 鹽，所述可溶性鹽的陰離子選自C〇32、S〇42、S2〇32、H2PO4、C1、N03、P〇4 3中的一種或多種； 所述可溶性鹽的陽離子選自κ\ Cu2\ Ca2\ Mg2\ Mn2\ Co2\化3\ M〇e\化沖的一種或多種。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在蛋白藥物Recombinant Textilinin-1處方中添加緩沖 劑、等滲劑、表面活性劑或氨基酸等可W實(shí)現(xiàn)提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性的效果。其中氨基酸 能夠可逆地鎖定蛋白質(zhì)表面區(qū)域從而阻止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，尤其是在高濃度蛋白溶 液中，添加氨基酸可W降低黏度對(duì)蛋白的影響，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此氨基酸作為 蛋白質(zhì)的保護(hù)劑，使用兩種或兩種W上不同的氨基酸的組合可W進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 性。
【附圖說明】
[0016] 圖1顯示了本發(fā)明實(shí)施例2中Recombinant Textilinin-1抑制纖溶酶活性的標(biāo) 準(zhǔn)曲線。
[0017] 圖2顯不了本發(fā)明實(shí)施例3中Recombinant Textilinin-1中間體來源。
[00化]圖3顯示了本發(fā)明實(shí)施例4中Recombinant Textilinin-1緩沖系統(tǒng)抑的選擇。
[0019] 圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中Recombinant Textilinin-1緩沖系統(tǒng)鹽濃度的選 擇。
[0020] 圖5顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中陰離子種類對(duì)plasmin的影響。
[0021] 圖6顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中陰離子種類對(duì)Recombinant Textilinin-1的影響。
[0022] 圖7顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中陰離子濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1活性的 影響
[0023] 圖8顯示了本發(fā)明實(shí)施例6中陽離子種類對(duì)纖溶酶活性的影響。
[0024] 圖9顯不了本發(fā)明實(shí)施例6中陽離子種類對(duì)Recombinant Textilinin-1的影響。 [00巧]圖10顯示了本發(fā)明實(shí)施例6中陽離子濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1活性的 影響。
[0026] 圖11顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中多元醇對(duì)纖溶酶活性的影響。
[0027] 圖12顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中多元醇對(duì)Recombinant Textilinin-1活性的影響。
[0028] 圖13顯示了本發(fā)明實(shí)施例7中多元醇濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1活性的 影響
[0029] 圖14顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中表面活性劑對(duì)纖溶酶的影響。
[0030] 圖15顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中表面活性劑對(duì)Recombinant Textilinin-1的影響。
[0031] 圖16顯示了本發(fā)明實(shí)施例8中表面活性劑濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1的 影響。
[0032] 圖17顯示了本發(fā)明實(shí)施例9中抑菌劑種類對(duì)纖溶酶的影響。
[0033] 圖18顯示了本發(fā)明實(shí)施例9中抑菌劑種類對(duì)Recombinant Textilinin-1的影響。
[0034] 圖19顯示了本發(fā)明實(shí)施例9中抑菌劑濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1的影響
[0035] 圖20顯示了本發(fā)明實(shí)施例10中氨基酸種類對(duì)纖溶酶活性的影響。
[0036] 圖21顯示了本發(fā)明實(shí)施例10中氨基酸種類及濃度對(duì)Recombinant Textilinin-1 的影響。
[0037] 圖22顯示了本發(fā)明實(shí)施例12中溫度對(duì)Recombinant Textilinin-1處方制劑的 影響
[0038] 圖23顯示了本發(fā)明實(shí)施例12中強(qiáng)光對(duì)Recombinant Textilinin-1處方制劑的 影響
[0039] 圖24顯示了本發(fā)明實(shí)施例12中濕度對(duì)Recombinant Textilinin-1處方制劑的 影響
【具體實(shí)施方式】
[0040] 為了更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一 步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的具體實(shí)施例僅是用于說明目的，而非對(duì)本發(fā)明的限制。 [0041 ]連施巧I IRecombinant textilinin-l 的制備
[0042] 本專利所設(shè)及的Recombinant textilinin-1是一種重組蛋白，其是通過申請(qǐng)?zhí)枮?201110178605. 6的專利所公開的方法制備得到的，具體制備方法如下：
[0043] 本發(fā)明設(shè)及的Recombinant textilinin-1的氨基酸序列為：SEQ NO 1:邸RPDFC ELPADTGPCRVRFPSFYYNPDE 邸化邸 IYGGCEGNANNFIT 邸 ECESTCAA。
[0044] 通過將人工合成的textilinin-1結(jié)構(gòu)基因在畢氏酵母菌中，W分泌表達(dá)的方式 大量產(chǎn)生獲得，依據(jù)textilinin-1的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼 子，人工合成textilinin-1結(jié)構(gòu)基因序列，該基因序列為：SEQ NO 2:AAG GAT AGA CCA GAT ΤΤΤ TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA MG MG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC AAC ΤΤΤ ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA。
[0045] 將人工合成textilinin-1結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體pPICZ a中利用 酵母菌的α -信號(hào)膚將重組textilinin-1移出細(xì)胞，其中在信號(hào)膚序列與textilinin-1 序列之間插入KEX2蛋白酶識(shí)別序列。
[0046] Recombinant textilinin-1的制備方法，通過發(fā)酵，得到發(fā)酵液（其發(fā)酵工藝參 數(shù)為：表達(dá)時(shí)抑值為3-5,表達(dá)溫度為23-25Γ )。并通過微濾、陽離子Capto MMC和陰離 子 Q hp 柱層析純化 textilinin-1，得到純度大于 99. 0% 的 Recombinant textilinin-1 產(chǎn) 品。
[0047] 連施巧I 2Recombinant textilinin-l的抑制纖溶酶活性測(cè)定 柳4引（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0049] 取迂寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的純度大于99. 0 %的Recombinant textilinin-1 標(biāo)準(zhǔn)液(0.07mg/ml Recombinant textilinin-1,50mmol/L Tris-HCl 抑7. 4,使其反應(yīng)終濃度分別為0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5PIU/L的6個(gè)點(diǎn)），在1ml反應(yīng)體系 里加入纖溶酶（終濃度為21. 75nM)，Buffer Uris-HClipH?. 4)，在37°C下解育30分鐘。再 加入S2251 (終濃度為225 μ mol/L)，迅速混勻，在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)405nm下，酶動(dòng)力學(xué) 模式進(jìn)行讀數(shù)，每30秒一次，共10分鐘，溫度控制在37Γ。收集數(shù)據(jù)，W時(shí)間（S)為橫坐 標(biāo)，W A405為縱坐標(biāo)做圖，得到斜率。再W Recombinant textilinin-1抑制纖溶酶活力 (PIU/L)為橫坐標(biāo)，W斜率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行一次線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)線性方程（如 圖1所示）。
[0050] (二）Recombinant textilinin-1樣品抑制纖溶酶活性的測(cè)定
[0051] 再取待測(cè)Recombinant textilinin-1稀釋成不同濃度，進(jìn)行同樣操作，得到 的不同斜率代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，W接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)為準(zhǔn)，代入標(biāo)準(zhǔn)方程中計(jì)算得到 Recombinant textilinin-1抑制纖溶酶活力，并根據(jù)質(zhì)量計(jì)算出比活力。
[0052] 連施巧I 3Recombinant textilinin-l未添加輔料中間體穩(wěn)定性研究
[0053] 隨機(jī)選取迂寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的Recombinant textilinin-1中 間體（微濾液、純化液、標(biāo)準(zhǔn)液及濃縮液，其來源及制備過程見圖2,分別放置在4°C和-20°C 保存，每隔1個(gè)月取一次樣，進(jìn)行活性測(cè)定，直到活性下降10%，各中間體保存期限見表1。
[0054] 表1Recombinant textilinin-1中間體未添加輔料的保存期限 陽化引
[0056] 如表1所示，Recombinant textilinin-1未添加輔料各階段的中間體保存期限不 同，運(yùn)與其存放溫度、純度及保存濃度有關(guān)，保存期限最長(zhǎng)為微濾液在-20°C保存12個(gè)月， 但雜質(zhì)較多。Recombinant textilinin-1各中間體均難W維持作為藥物制劑在生產(chǎn)運(yùn)輸、 儲(chǔ)存、上架售賣等條件下的穩(wěn)定性，因此需要進(jìn)行添加輔料對(duì)Recombinant textilinin-1 穩(wěn)定性影響的考察。
[0057] 連施巧I 4Recombinant textilinin-l適用緩沖系統(tǒng)抑及濃度范圍的選擇
[0058] (一）適用緩沖系統(tǒng)抑的篩選
[0059] 隨機(jī)選取迂寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的Recombinant textilinin-1 濃縮液，用不同抑的50mmol/L Tris-HCl或50mmol/L胞2冊(cè)〇4-化&?〇4憐酸鹽配制成稀 釋液燈ris-HCl緩沖液和憐酸鹽緩沖液的配制方法如表2所示），吸取待測(cè)Recombinant textilinin-1稀釋液置于比色皿中進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果見圖2。 W60] 表2Tris-HCl緩沖液和憐酸鹽緩沖液的配制 [0061]
陽〇6引如圖3所示，Recombinant textilinin-1的相對(duì)酶活力受到緩沖劑的抑值的影 響，其中，當(dāng)化is-HCl緩沖液抑為7. 2~7. 8時(shí)Recombinant textilinin-1具有較高的 酶活力，并且在抑為7. 4時(shí)酶活力最高；當(dāng)憐酸鹽緩沖液抑為7. ο~7. 4時(shí)Recombinant textilinin-1具有較高的酶活力，并且在pH為7. 0時(shí)酶活力最高。因此，Tris-HCl緩沖液 抑適用范圍為7. 2~7. 8,優(yōu)選為抑7. 4 ;憐酸鹽緩沖液抑適用范圍為7. 0~7. 4,優(yōu)選為 pH7. 0〇 柳64](二）適用緩沖液濃度的篩選
[00化]隨機(jī)選取迂寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的Recombinant textilinin-1 濃縮液，用不同濃度的化is-HCl或憐酸鹽配制成稀釋液，吸取待測(cè)Recombinant textilinin-1稀釋液置于比色皿中進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果見圖4。
[0066] 如圖4所不，在抑緩沖劑的濃度為50mmol時(shí)Recombinant textilinin-1的酶活 力達(dá)到最高，隨后隨著濃度的升高逐漸降低，至緩沖劑的濃度達(dá)到70mmol/L時(shí)變化趨緩， 在緩沖劑濃度為lOOmmol/L時(shí)趨于穩(wěn)定。因此，化is-HCl緩沖液鹽濃度對(duì)于Recombinant textilinin-1的適用范圍為50-150mmol/L優(yōu)選50mmol/L ;憐酸鹽緩沖液鹽濃度對(duì)于 Recombinant textilinin-1 的適用范圍為 5〇-150mmol/L優(yōu)選為 5〇-70mmol/L。
[0067] 連施例5陰離子對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響 !；00側(cè)（一）陰離子種類對(duì)Recombinant textilinin-l穩(wěn)定性的影響 W例取不同種類的陰離子，用50mmol/L的抑7. 4的Tris-肥1稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中含有50mmol/L的陰離子，并放置于溫度60°C下約18小時(shí)， 再進(jìn)行測(cè)定，稀釋到1ml反應(yīng)體系中，使Recombinant textilinin-1反應(yīng)終濃度為5nmol/ L在紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行活性測(cè)定，不同陰離子的Recombinant textilinin-1在加熱前 后分別測(cè)定活性，此Recombinant textilinin-1相對(duì)酶活力為同種類陰離子加熱后的活性 與加熱前活性的比值。為了去除陰離子對(duì)纖溶酶的影響，用同樣濃度的陰離子測(cè)定纖溶酶 的活性，空白為稀釋液，每個(gè)樣品重復(fù)4次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖5和6。
[0070] 圖5表明不同種類陰離子對(duì)纖溶酶的影響無顯著性差異（P〉0. 05)，圖6表明僅 C〇32和S 2032對(duì)Recombinant textilinin-1的活性產(chǎn)生了顯著性差異（P<0. 05)，具有抑制 作用，其余陰離子均無顯著性差異（P〉〇. 05)，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生 影響。
[0071] (二）陰離子濃度對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0072] 取對(duì)Recombinant textilinin-1活性無影響的幾種陰離子，用抑7. 4的50mmol/ LTris-HCl 稀釋液稀釋，使 Img/ml 的 Recombinant textilinin-1 中分別含有 20、50、70、 100、150mmol/L五種不同濃度的陰離子，并放置于溫度60°C下約18小時(shí)，再進(jìn)行測(cè)定，稀釋 至Ij 1ml反應(yīng)體系中，使Recombinant textilinin-1反應(yīng)終濃度為5]11]1〇1/^，在紫外分光光度 計(jì)中進(jìn)行活性測(cè)定，不同陰離子的Recombinant textilinin-1在加熱前后分別測(cè)定活性， 此Recombinant textilinin-1相對(duì)酶活力為同種類陰離子加熱后的活性與加熱前活性的 比值?？瞻诪橄♂屢?，每個(gè)樣品重復(fù)4次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖7。
[0073] 圖7表明陰離子不同濃度對(duì)Recombinant textilinin-1的活性影響無顯著性差 異（P〉0. 05)，即對(duì) Recombinant textilinin-1 活性不產(chǎn)生影響。
[0074] 連施例6陽離子對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響 [00巧](一）陽離子種類對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0076] 取不同種類的陽離子，用抑7. 4的50mmol/L Tris-HCl稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中含有50mmol/L的陽離子，測(cè)定方法同實(shí)施例4,結(jié)果見圖8 和9。
[0077] 圖8表明化2+離子對(duì)纖溶酶的抑制作用非常顯著（P<0. 01)，其他陽離子對(duì)纖溶酶 的活性影響均無顯著性（P〉〇. 05)。圖9表明化2+離子對(duì)Recombinant textilinin-1的活 性提高產(chǎn)生了顯著性差異（P<〇. 05)，運(yùn)是由于化2+對(duì)纖溶酶有抑制作用所產(chǎn)生的，其余陽 離子均無顯著性差異（P〉〇. 05)，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響。
[0078] (二）陽離子濃度對(duì)Recombinant textilinin-1活性的影響
[0079] 取對(duì)Recombinant textilinin-1活性無影響的幾種陽離子，用抑7. 4的50mmol/ LTris-HCl 稀釋液稀釋，使 Img/ml 的 Recombinant textilinin-1 中分別含有 20、50、70、 100、150mmol/L五種不同濃度的陽離子，并放置于溫度60°C下約18小時(shí)，再進(jìn)行測(cè)定，方法 同實(shí)施例4(二），結(jié)果見圖10。
[0080] 圖10表明陽離子不同濃度對(duì)Recombinant textilinin-1的活性影響無顯著性差 異（P〉0. 0巧，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響。
[0081] 連施例7《元醇對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0082] ( 一）多元醇種類對(duì)Recombinant textilinin-1活性的影響
[0083] 取不同種類的多元醇，用抑7. 4的50mmol/L Tris-HCl稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中含有多元醇的濃度分別為甘油2%、甘露醇5%、山梨醇5%、 聚乙二醇30% (均為重量體積百分比，W下同），測(cè)定方法同實(shí)施例5 ( -），結(jié)果見圖11和 12。
[0084] 圖11表明多元醇對(duì)纖溶酶的活性影響均無顯著性（P〉0. 05)。圖12表明多元醇 對(duì)Recombinant textilinin-1的活性的影響均無顯著性差異（P〉0. 0巧，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響。
[00化](二）多元醇濃度對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0086] 取4種多元醇，用抑7. 4的50mmol/L Tris-HCl稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中多元醇的濃度分別為甘油1%、2%、3%，甘露醇2.5%、5%、 7.5%，山梨醇2.5%、5%、7.5%，聚乙二醇15%、30%，45%，并放置于溫度60°(：下約18小 時(shí)，再進(jìn)行測(cè)定，方法同實(shí)施例4 (二），結(jié)果見圖13。
[0087] 圖13表明多元醇不同濃度對(duì)Recombinant textilinin-1的活性影響無顯著性差 異（P〉0. 0巧，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響。
[0088] 連施巧I 8表面活性劑對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0089] (一）表面活性劑對(duì)Recombinant textilinin-1活性的影響
[0090] 取聚山梨醋20和聚山梨醋80,用抑7. 4的50mmol/L Tris-肥1稀釋液稀釋，使 Img/ml的Recombinant textilinin-1中含有表面活性劑的濃度為0.01% (均為重量體積 百分比，W下同），測(cè)定方法同實(shí)施例5 ( -），結(jié)果見圖14和15。
[0091] 圖14表明表面活性劑對(duì)纖溶酶的活性影響均無顯著性（P〉0. 05)。圖15表明表 面活性劑對(duì)Recombinant textilinin-1的活性的影響均無顯著性差異（P〉0. 05)，即對(duì) Recombinant textilinin-1 活性不產(chǎn)生影響。
[0092] (二）表面活性劑濃度對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響 陽09引取4種抑菌劑，用抑7. 4的50mmol/L Tris-肥1稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中表面活性劑的濃度分別為0. 01 %、0. 05%、0. 15%，并放置于 溫度60°C下約18小時(shí)，再進(jìn)行測(cè)定，方法同實(shí)施例5 (二），結(jié)果見圖16。
[0094] 圖16表明表面活性劑不同濃度對(duì)Recombinant textilinin-1的活性影響無顯著 性差異（P〉〇. 05)，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響。
[00巧]連施巧I 9抑蔭劑對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0096] ( 一）抑菌劑種類對(duì)Recombinant textilinin-1活性的影響
[0097] 取不同種類的抑菌劑，用抑7. 4的50mmol/L Tris-HCl稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中含有抑菌劑的濃度分別為Ξ氯叔下醇0. 5%、苯酪0. 5%、苯 甲醇2%、間甲酪0. 3% (均為重量體積百分比，W下同），測(cè)定方法同實(shí)施例5 ( -），結(jié)果 見圖17和18。
[0098] 圖17表明抑菌劑對(duì)纖溶酶的活性影響均無顯著性（P〉0. 05)。圖18表明抑菌劑 對(duì)Recombinant textilinin-1的活性的影響均無顯著性差異（P〉0. 05)，即對(duì)Recombinant textilinin-1活性不產(chǎn)生影響，可根據(jù)制劑規(guī)格確定是否添加。
[0099] (二）抑菌劑濃度對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響
[0100] 取4種抑菌劑，用抑7. 4的50mmol/L Tris-肥1稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中多元醇的濃度分別為Ξ氯叔下醇0. 25%、0. 5%、0. 75%，苯 酪 0. 25%、0. 5%、0. 75%，苯甲醇 1%、2%、3%，間甲酪 0. 15%、0. 30%，0. 45%，并放置于 溫度60°C下約18小時(shí)，再進(jìn)行測(cè)定，方法同實(shí)施例4(二），結(jié)果見圖19。 陽101] 圖19表明抑菌劑不同濃度對(duì)Recombinant textilinin-1的活性影響無顯著性差 異（P〉0. 05)，即對(duì) Recombinant textilinin-1 活性不產(chǎn)生影響。 陽102] 連施例10氨基酸對(duì)Recombinant textilinin-1穩(wěn)定性的影響 陽10引取不同種類的氨基酸，用抑7. 4的50mmol/L Tris-肥1稀釋液稀釋，使Img/ml的 Recombinant textilinin-1中含有氨基酸的濃度為20mmol/L測(cè)定對(duì)纖溶酶的影響，方法 同實(shí)施例5 ( -），結(jié)果見圖20,另取不同種類的氨基酸，用抑7. 4的50mmol/L化is-HCl稀 釋液稀釋，使Img/ml的Recombinant textilinin-1中含有氨基酸的濃度分別為20mmol/L 和lOOmmol/L，測(cè)定對(duì)Recombinant textilinin-1活性的影響，結(jié)果見圖21。
[0104] 圖20表明所有氨基酸對(duì)纖溶酶的活性影響均無顯著性（P〉0. 05)。圖21表明甘 氨酸對(duì)Recombinant textilinin-1的活性的影響有顯著性差異（P<0. 05)，其余氨基酸對(duì) Recombinant textilinin-1 活性均不產(chǎn)生影響（P〉0. 0巧。 陽 105]連施例 llRecombinant textilinin-l 制劑處方 陽106] (一）Recombinant textilinin-1制劑處方中甲硫氨酸的影響 陽107] 按照表中組成配制制劑燈ween20和山梨醇均為重量體積百分比，W下同），60°C 過夜放置，稀釋至適當(dāng)濃度，進(jìn)行活性測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)Ξ次。 陽10引 表3Recombinant textilinin-1處方組成及結(jié)果 陽 109]
[0110] 結(jié)果可見，加輔料組（7組）優(yōu)于空白組（4、5、6組），加甲硫氨酸組（1、2、3、8、 9組）優(yōu)于加輔料組（7組）。說明輔料Tween20和山梨醇對(duì)Recombinant textilinin-1 溶液活性有保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，氨基酸（甲硫氨酸）更進(jìn)一步增加了 Recombinant textilinin-1溶液的穩(wěn)定性。 陽1?](二）Recombinant textilinin-1制劑處方中多種氨基酸的影響
[0112] 選取賴氨酸（A)、甘氨酸度)、甲硫氨酸似、組氨酸值)、脯氨酸巧)、谷氨酸（F) 為氨基酸添加劑，加到含輔料的樣品中（Img/ml Recombinant textilinin-1+O. 15% Tween20+3%山梨醇中），并考慮到氨基酸之間的交互作用，進(jìn)行兩兩組合及Ξ種組合在一 起，60°C過夜放置，W加熱后活性比加熱前的活性為相對(duì)殘留活性，試驗(yàn)重復(fù)四次。
[0113] 表4Recombinant textilinin-1處方中氨基酸組成及結(jié)果 陽114]
陽115]
[0116] 結(jié)果表明，上述含氨基酸制劑處方組活性穩(wěn)定性好。尤其是單種氨基酸或組合氨 基酸濃度為25mmol/L時(shí)，制劑的穩(wěn)定性更好，說明氨基酸對(duì)蛋白活性起到一定的保護(hù)作 用。
[0117] 連施例12Recombinant textilinin-l制劑處方穩(wěn)定性考察
[0118] 按照表5配制3個(gè)制劑組，同時(shí)配制包括空白組（只有Img/ml的Recombinant Textinlinin)、輔料空白組（Img/ml Recombinant TextinliniruO. 15% Tween20、3% 山梨 醇），Tween20和山梨醇濃度均為重量體積百分比，W下同。每組設(shè)定5個(gè)平行。5組制劑 分別在高溫（60°C和40°C )、強(qiáng)光照射（45001x±5001x)和高濕（90% ±5% )的條件下，考 察Recombinant textilinin-1制劑的穩(wěn)定性，考察期為10天，分別于0、5、10天取樣，考察 樣品的外觀、HPLC(表6)、活性分析（圖22-24)。
[0119] 表 5Recombinant textilinin-1 制劑處方組成表 陽 120]
陽121] 表6Recombinant textilinin-1處方制劑影響因素試驗(yàn) 陽1。]
[0123] 經(jīng)過各影響因素和5天、10天取樣觀察，樣品外觀沒有變化，呈無色透明。從HPLC 和活性測(cè)定結(jié)果表明：處方組間（1、2、3)差異不大，但純度明顯好于輔料空白組，而且輔料 空白組略好于空白組。處方組能夠在高溫（60°C和40°C )、強(qiáng)光照射及濕度條件下很好的保 護(hù) Recombinant textilinin-1 的活性。
[0124] 連施例13Recombinant textilinin-l對(duì)組織纖溶酶原激活物（t-PA)誘導(dǎo)的大鼠 纖溶亢進(jìn)的止血作用
[0125] (一）大鼠纖溶亢進(jìn)模型的建立 陽1%] 選擇試驗(yàn)用雄性SD大鼠，體重在200~300g，適應(yīng)1周后，隨機(jī)分成5組，每組6 只。腹腔注射戊己比妥鋼巧Omg/kg)麻醉大鼠，暴露大鼠右頸靜脈，將充滿生理鹽水的聚乙 締導(dǎo)管插入右頸靜脈。導(dǎo)管的另一端連接到注射累，注射累的給藥速度為t-PA 3mg/kg/h、 t-PA 5mg/kg/h、t-PA 8mg/kg/h 和 t-PA lOmg/kg/h，空白組給予生理鹽水。t-PA 給藥 10 分鐘后，距大鼠尾尖2mm處切斷鼠尾，并繼續(xù)給予t-PA。將鼠尾浸入37°C生理鹽水中，觀 察30分鐘內(nèi)的出血情況，并記錄分析。觀察結(jié)束后，下腔靜脈采血4mU用含1/10體積的 3. 2%構(gòu)祿酸鋼抗凝，2000g離屯、15分鐘，4°C。收集血漿，儲(chǔ)存在-80°C，用于后期檢測(cè)，檢 測(cè)指標(biāo)為出血時(shí)間、PT、aPTT、FBI和D2D。選取出血時(shí)間延長(zhǎng)至30分鐘的t-PA最小劑量 用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表7。 陽127] 試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，各劑量t-PA均可延長(zhǎng)尾部出血時(shí)間至30分鐘。t-PA可劑 量依賴降低血漿纖維蛋白原（FBI)的濃度。四個(gè)劑量的t-PA均可延長(zhǎng)活化部分凝血活酶 時(shí)間（aPTT)，但對(duì)凝血酶原時(shí)間（PT)無顯著影響。高劑量t-PA組增加血漿中D二聚體的 含量，可能由于尾部出血模型導(dǎo)致凝血功能素亂所致。 陽12引表7不同劑量t-PA對(duì)大鼠止血時(shí)間和血液生化指標(biāo)的影響 陽 129]
[0130] *p<0. 05, *卸<0. 001，***p<0. 001 與空白組相比 陽 131](二）Recombinant textilinin-1 藥效試驗(yàn)
[0132] 選擇試驗(yàn)用雄性SD大鼠，體重在200~300g，適應(yīng)1周后，隨機(jī)分成7組，每 組6只。腹腔注射戊己比妥鋼巧Omg/kg)麻醉大鼠，暴露大鼠右頸靜脈，將充滿生理鹽 水的聚乙締導(dǎo)管插入右頸靜脈。導(dǎo)管的另一端連接到注射累，注射累的給藥速度為t-PA 3mg/kg/h，空白組給予生理鹽水。t-PA給藥10分鐘后，給予纖溶酶抑制劑巧ecombinant textilinin-1、抑膚酶aprotinin和氨甲環(huán)酸TXA)，各組頸靜脈注射+持續(xù)灌注給藥（見 表）。給藥5分鐘后，距大鼠尾尖2mm處切斷鼠尾，并繼續(xù)給予t-PA。將鼠尾浸入37°C生理 鹽水中，觀察30分鐘內(nèi)的出血情況，并記錄分析。觀察結(jié)束后，下腔靜脈采血4mU用含1/10 體積的3. 2%構(gòu)祿酸鋼抗凝，2000g離屯、15分鐘，4°C。收集血漿，儲(chǔ)存在-80°C，用于后期檢 巧。，檢測(cè)指標(biāo)為出血時(shí)間、PT、aPTT、FBI和D2D。選取出血時(shí)間延長(zhǎng)至30分鐘的t-PA最小 劑量用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表8。 陽1；33] 試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，各劑量Recombinant textilinin-1均可有效抑 制t-PA3mg/kg/h引起的尾部出血時(shí)間延長(zhǎng)，W及FIB水平減少，其中Recombinant textilinin-120mg/kg+40mg/kg/h 和 40mg/kg+80mg/kg/h 劑量效果明顯，與 aprotinin 5mg/kg+10mg/kg/h，TXA300mg/kg/h 治療效果相當(dāng)。各劑量的 Recombinant textilinin-1 對(duì)ΡΤ、aPTT及D2D無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)表明Recombinant textilinin-1能明顯抑制纖溶 亢進(jìn)型出血，為臨床應(yīng)用提供了可靠依據(jù)。
[0134] 表SRecombinant textilinin-1對(duì)t-PA誘導(dǎo)的纖溶亢進(jìn)的抑制作用 陽 135]
[0136] *p<0. 05, *卸<0. 001，*和咕<0. 001 與空白組相比
[0137] 盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了詳細(xì)說明和描述，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā) 明不受所述【具體實(shí)施方式】的限制。在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可W對(duì)本發(fā)明做 出各種改進(jìn)、修飾和變化，而運(yùn)些改進(jìn)、修飾和變化均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的注射劑，其特征在于，所述注射劑包含0. 〇5mg/ml~ 30mg/ml的絲氨酸蛋白酶抑制劑Recombinant Textilinin-I和pH緩沖劑、表面活性劑、多 元醇、氨基酸和抑菌劑。2. 權(quán)利要求1所述的注射劑，其特征在于，所述Recombinant Textilinin-I的氨基酸 序列為 SEQ NO 1:KDRPDFCELPADTGPCRVRFPSFYYNPDEKKC LEFIYGGCEGNANNFITKEECESTCAA。3. 權(quán)利要求1所述的注射劑，其特征在于，所述pH緩沖劑為pH7. 2~7. 8的Tris-HCl 或pH7. 0~7. 4的磷酸鹽緩沖液；優(yōu)選地，所述pH緩沖劑濃度為50mmol/L ;更優(yōu)選地，所述 pH緩沖劑為pH7. 4的Tris-HCl緩沖液或pH7. 0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。4. 如權(quán)利要求1或2或3所述的注射劑，其特征在于，所述表面活性劑為聚山梨 酯80或聚山梨酯20的一種；優(yōu)選地，所述表面活性劑的含量為lmg/ml的Recombinant textilinin-l對(duì)應(yīng)的表面活性劑的濃度為0. 1~I. 5mg/ml。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的注射劑，其特征在于，所述多元醇選自甘油、甘露 醇、山梨醇或聚乙二醇中的一種或多種，優(yōu)選為山梨醇。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的注射劑，其特征在于，所述多元醇的濃度為20~ 50mg/ml〇7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的注射劑，其特征在于，所述氨基酸的總濃度為5~ 30mmol/L;優(yōu)選地，所述氨基酸選自甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸中 的一種或多種。8. 如權(quán)利要求7所述的注射劑，其特征在于，所述氨基酸由賴氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸 組成；優(yōu)選地，所述各種氨基酸的總濃度為25mmol/L ;更優(yōu)選地，所述的氨基酸中賴氨酸的 濃度為l〇mmol/L，甘氨酸濃度為5mmol/L，甲硫氨酸的濃度為10mmol/L。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的注射劑，其特征在于，所述抑菌劑的濃度為1. 5~ 30mg/ml，所述抑菌劑選自三氯叔丁醇、苯酚、苯甲醇和間甲酚中的一種或多種。10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的注射劑，其特征在于，所述注射劑還包含濃度 為50mmol/L的可溶性鹽，所述可溶性鹽的陰離子選自CO 32、SO42、S2O3 2、H2PO4、Cl、NO3、 PO43中的一種或多種；所述可溶性鹽的陽離子選自K+、Cu2+、Ca 2+、Mg'Mn2+、Co2+、Fe'Mo6+、 Na+中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】A61K47/22GK105879018SQ201510038723
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月26日
【發(fā)明人】徐梅, 李娜, 李秀娜, 王振宇, 陳宏超, 薛雁, 王宏英, 薛百忠
【申請(qǐng)人】遼寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司