專(zhuān)利名稱(chēng)：光活(一)黃皮酰胺制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光活黃皮酰胺制備方法以及光活黃皮酰胺用于治療老年癡呆的潛在性藥物用途。
目前我國(guó)人口的平均壽命已超過(guò)70歲，比解放時(shí)的人均壽命增加了一倍。國(guó)外一項(xiàng)科學(xué)研究預(yù)測(cè)到2025年時(shí)，15歲以下兒童的比例將占總?cè)丝诘?8.6％，而65歲及65歲以上的老年人將超過(guò)童數(shù)，達(dá)到18.8％，這個(gè)數(shù)字表明，再過(guò)20余年，每5個(gè)人中就有1個(gè)老年人。早老性癡呆癥(Alzheimer’s Disease)多發(fā)生在50余歲。因腦血管病變引發(fā)的多發(fā)性栓塞性癡呆或老年性癡呆多發(fā)生在60歲以后?？梢?jiàn)，由于人口的老齡化，早老性癡呆癥和老年性癡呆癥的發(fā)病率也必將增加。老年人及其特有的神經(jīng)退化性疾病——各種癡呆癥要經(jīng)歷兩種死亡，首先是精神上的死亡，后是肉體上的死亡，苦不堪言，更給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。人口老齡化被認(rèn)為是僅次于戰(zhàn)爭(zhēng)，瘟疫，饑荒，資源能源短缺而影響社會(huì)發(fā)展和安定的不利因素。
防治衰老和治療老年癡呆的藥物種類(lèi)繁多，如腦血管擴(kuò)張藥，通過(guò)改善腦血流量有助于提供能量和改善智能，但真正有價(jià)值的腦血管擴(kuò)張藥必須具有高度選擇性，不影響腦代謝，無(wú)“竊血”現(xiàn)象，有抗血小板聚集和抗血栓作用。鈣拮抗劑尼莫地平雖符合上述某些條件，但它僅作用于電壓依賴性鈣通道中的L通道，對(duì)N型和T型鈣通道無(wú)影響。增強(qiáng)膽堿系統(tǒng)功能的藥物中，Ach前體僅有微弱的治療作用，Ach受體激動(dòng)劑和膽堿脂酶抑制劑雖有一定效果，但作用較短暫，毒副作用較大。多種神經(jīng)肽和神經(jīng)生長(zhǎng)因子曾被認(rèn)為有治療癡呆癥的希望，但臨床效果不佳，可能主要?dú)w因于這類(lèi)物質(zhì)難以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用，2吡咯烷酮乙酰胺(piracetam國(guó)內(nèi)已生產(chǎn)，商品名腦復(fù)康)問(wèn)世后，在早期文獻(xiàn)中屬?zèng)]有爭(zhēng)論的一類(lèi)新型促智藥(nootropil，該詞是從希臘詞noo(腦)和tropein(向)衍化而來(lái))，近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，該藥對(duì)各類(lèi)型的記憶障礙和老年癡呆作用輕微或尚無(wú)定論，一個(gè)主要原因是該藥為水溶性化合物，通過(guò)血腦屏障率低，不易集中到靶點(diǎn)發(fā)揮作用。
本申請(qǐng)人從蕓香科植物黃皮[Clausena Lansium(lour.)Skells]中第一次分離出含有腦復(fù)康藥的γ內(nèi)酰胺骨架的化合物，稱(chēng)之為黃皮酰胺(Clausenamide)。黃皮酰胺是具有四個(gè)手性中心的γ內(nèi)酰胺，天然品為消旋體，消旋黃皮酰胺的合成方法曾申請(qǐng)歐洲專(zhuān)利，其申請(qǐng)?zhí)枮镋P0414020。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)86107090，90107145.5和90107144.7。
現(xiàn)有技術(shù)中，消旋(±)黃皮酰胺的制備路線和方法如下 但是，這種方法不能直接用于制備本發(fā)明所述的具有光學(xué)活性的黃皮酰胺或其衍生物。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種光學(xué)活性黃皮酰胺或其衍生物；本發(fā)明的另一目的目的在于提供一種光學(xué)活性黃皮酰胺的制備方法；本發(fā)明的另一目的在于提供一種該光學(xué)活性化合物(-)黃皮酰胺在制備促智，抗衰老作用藥物的應(yīng)用。
現(xiàn)對(duì)(-)、(+)黃皮酰胺的制備方法，促智，抗衰老作用及其可能的作用機(jī)制報(bào)道于后。本發(fā)明所述的化合物具有如下通式(I)所示的結(jié)構(gòu)，其絕對(duì)構(gòu)型為(3S，4R，5R，6S)，具有左旋光性，其中R1及R2可以是H、鹵素、C1-6的烷基、 烷氧基、次甲二氧基、硝基；也可以是多取代；R1和R2可以相同，也可以不同。R1，R2＝H時(shí)，為(-)黃皮酰胺，另外，本發(fā)明也包括制備過(guò)程中的產(chǎn)生的光活中間體。
本文中*表示為光活物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及一種制備具有如通式I所示的光活化合物的方法，它是一種不對(duì)稱(chēng)從頭(de novo)合成法，該本合成法采用分子內(nèi)誘導(dǎo)不對(duì)稱(chēng)Darzen’s反應(yīng)，以光活R*為配體。它包括以下步驟(1)以氯乙酰氯與手性醇R*OH形成手性醇的氯乙酸酯(1)*；所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。
(2)得到的手性醇的氯乙酸酯與苯甲醛或R1取代的苯甲醛反應(yīng)，獲得相應(yīng)光活的芳基縮甘油酸手性醇酯(2a)*、(2b)*；(3)經(jīng)酯交換得(+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*，(4)得到的+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*與相應(yīng)的胺縮合得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羥基-苯乙基)-3-苯基縮水甘油酰胺(3)*，再經(jīng)氧化得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺(4)*；(5)所述的(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺(4)*在堿性條件下環(huán)合得光活(-)黃皮酰胺酮(5)*所述的堿包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、二異丙胺基鋰，丁基鋰，四烷基氫氧化胺及三烷基胺。
環(huán)合時(shí)使用的溶劑為水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它們的混合物，如甲醇和水等。
(6)光活黃皮酰胺酮(5)*經(jīng)硼氫化鈉還原可得光活黃皮酰胺或其衍生物。
應(yīng)當(dāng)指出的是在上述的方法中，所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。環(huán)合步驟所用的堿包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、二異丙胺基鋰，丁基鋰，四烷基氫氧化胺及三烷基胺。環(huán)合時(shí)使用的溶劑為水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它們的混合物。
本發(fā)明的光活黃皮酰胺或其衍生物還可以經(jīng)另一步驟制得。換言之，本發(fā)明的光活的黃皮酰胺及其衍生物可通過(guò)中間體拆分法獲得。
1.化學(xué)拆分方法在本發(fā)明的方法中，可以利用消旋黃皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羥基與拆分劑手性酸成酯，然后經(jīng)重結(jié)晶或?qū)游龇蛛x所得一對(duì)差向異構(gòu)體。
該拆分劑手性酸包括L孟氧乙酸，樟腦磺酸、(-)S鄰苯二甲酰丙氨酸或者N-對(duì)甲苯磺酰脯氨酸，優(yōu)選的是(-)S鄰苯二甲酰丙氨酸。
該方法包括以下步驟利用中間體消旋黃皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羥基與手性酸成酯，然后經(jīng)重結(jié)晶或?qū)游龇蛛x得一對(duì)差向異構(gòu)體。
具體地講，是將(-)-S-鄰苯二甲酰丙氨酸，在SOCl2的存在下，在甲苯中與消旋黃皮酰胺酮反應(yīng)，得到(-)-(3S，4R，5R)-5-苯甲?；?1-甲基-4-苯基-3-[(S)-α-(鄰苯二甲酰亞胺基)丙酰氧基]吡咯烷-2-酮和(+)-(3S，4R，5R)-5-苯甲?；?1-甲基-4-苯基-3-[(S)-α-(鄰苯二甲酰亞胺基)丙酰氧基]吡咯烷-2-酮。經(jīng)重結(jié)晶得旋光為(-)的差向異構(gòu)體，后者在NaBH4和NaOH的存在下水解，經(jīng)減壓濃縮，重結(jié)晶得到本發(fā)明的(-)黃皮酰胺。
另外，將消旋黃皮酰胺酮投入(-)孟氧乙酰氯的CH2Cl2溶液中，室溫反應(yīng)，反應(yīng)物經(jīng)重結(jié)晶，得(-)-(3S，4R，5R)-5-苯甲酰基-3-孟氧乙酰氧基-1-甲基-4苯基吡咯烷-2-酮。后者以對(duì)甲苯磺酸水解，得光活(-)黃皮酰胺酮，然后，按照上述步驟(b)經(jīng)NaBH4還原，制得(-)黃皮酰胺。
2酶拆分方法可以利用酶對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的不同反應(yīng)速度，可以將消旋的3-苯基縮水甘油酸甲酯經(jīng)酶拆分的方法制得(+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*，其中，采用具有產(chǎn)生水解酶能力的選自真菌，細(xì)菌，酵母，和放線菌的微生物在培養(yǎng)基中，pH為5-8，溫度為10-50℃，優(yōu)選為20～40℃下有氧發(fā)酵，所產(chǎn)生的菌絲對(duì)化合物(+)β-苯基縮水甘油酸甲酯進(jìn)行立體選擇性水解反應(yīng)，其水解反應(yīng)的pH值介于5～10之間，溫度為10-50℃，分離萃取得到光活性黃皮酰胺。
在本發(fā)明之酶拆分方法中使用的，具有產(chǎn)生水解酶的能力的微生物可以是真菌，細(xì)菌，酵母，和放線菌。這些細(xì)菌包括如無(wú)色桿菌(Achromobacter，sp)，產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes，sp)，節(jié)桿菌(Archrobacter，sp)，芽孢桿菌(Bacillus sp)，短桿菌(Breubacillus，sp)，棒桿菌(Corynebacterium，sp)，歐文氏菌(Erwinia sp)，假單孢菌(Pseudomonas sp)屬，酵母的假絲酵母(Candidasp)和畢赤(Pichiasp)，紅酵母(Rhadatorula sp)，漢蓀酵母(Hansenula sp)屬，真菌中的曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucor sp)，米曲霉(Aspergillus，sp)，青霉(Penicillium)，根霉(Rhizopus sp)以及放線菌中的諾卡氏(Nocardia sp)，鏈霉菌(Streptomycessp)等菌株均有這種產(chǎn)酶能力。這些菌種很容易從市場(chǎng)上得到。
在培養(yǎng)基中也可以加入表面活性劑，以增大底物在緩沖溶液中的溶解度，表面活性劑包括聚乙二醇、吐溫、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化銨，表面活性劑的濃度控制在0.05～5％，優(yōu)選為0.5～2％。
在上述的立體選擇性水解反應(yīng)中，底物的濃度可以控制在0.05～10％之間，最好為0.5～5％，pH為5～11，最好為6～9。
所述的立體選擇性水解反應(yīng)可以在緩沖液和有機(jī)溶劑中兩相中進(jìn)行，所述的有機(jī)溶劑包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、異丙醚、四氯化碳、氯仿，優(yōu)選是甲苯或二甲苯或異丙醚。
所述的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、鄰苯二甲酸緩沖液、酒石酸緩沖液、二乙基巴比妥酸鈉緩沖液、2，4，6-三甲基吡啶-鹽酸緩沖液、2-氨基-2-羥甲基-(1，3)丙二醇-鹽酸緩沖液，檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和N-乙基嗎啉-鹽酸緩沖液。
換言之，培養(yǎng)上述微生物，可產(chǎn)生上述水解酶，發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞均可用作酶源。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的包括碳源，氮源的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物和常用的無(wú)機(jī)鹽。發(fā)酵在加熱或常溫，優(yōu)選在20～40℃下，有氧的情況下進(jìn)行，pH值介于5～8之間。
立體選擇性的水解反應(yīng)可在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行。所述的有機(jī)溶劑包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、異丙醚、四氯化碳、氯仿，優(yōu)選是甲苯或二甲苯或異丙醚。
底物的濃度可控制在0.05～10％之間，優(yōu)選在0.5～5％之間。反應(yīng)可在室溫或在加熱的情況下進(jìn)行，加熱溫度優(yōu)選在10～50℃之間，反應(yīng)液的pH值對(duì)水解反應(yīng)也有很大的影響，因此反應(yīng)過(guò)程中要調(diào)節(jié)pH值并控制在5～10之間，優(yōu)選在6～9之間。
外消旋β-苯基縮水甘油酸甲酯的酶促水解反應(yīng)可在緩沖溶液中進(jìn)行，也可在緩沖溶液和如甲苯、苯、乙醚、乙酸乙酯、異丙醚，二甲苯，四氯化碳，氯仿等兩相有機(jī)溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選的有機(jī)溶劑為甲苯，二甲苯，異丙醚。
將光學(xué)活性β-苯基縮水甘油酸甲酯從反應(yīng)體系中的分離純化可按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法進(jìn)行。
由于反應(yīng)過(guò)程中有苯乙醛生成，因此產(chǎn)物須用飽和亞硫酸氫鈉的水溶液進(jìn)行洗滌。
如果反應(yīng)是在水相和有機(jī)相兩相間進(jìn)行，則將有機(jī)相分離出來(lái)，水層以有機(jī)溶劑萃取，合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉水溶液洗滌，干燥，濃縮。若反應(yīng)是在水相中進(jìn)行，則以有機(jī)溶劑萃取，并以飽和的亞硫酸氫鈉水溶液洗滌，干燥，濃縮。
因此，按照上述酶拆分方法可以得到(+)β-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*，可作為合成(-)黃皮酰胺的關(guān)鍵中間體。
經(jīng)本發(fā)明方法得到的(-)黃皮酰胺對(duì)正常鼠或記憶障礙鼠的記憶改善作用所需口服劑量為5～10mg·kg-1，而(+)黃皮酰胺無(wú)效?，F(xiàn)有技術(shù)中，曾對(duì)(±)、(+)、(-)黃皮酰胺的易化學(xué)習(xí)、記憶及加強(qiáng)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的作用及其與腦復(fù)康(Piracetam)的比較進(jìn)行了詳細(xì)研究。
腦復(fù)康的口服有效劑量為500mg·kg-1，(Dall R.Demographic andepidemiological trends today.InWolff HP et al eds.Drug research and drugdevelopment in 21’st century.BerlinSpring-verlag.199825-26.)，故(-)黃皮酰胺改善記憶作用的強(qiáng)度是腦復(fù)康的50～100倍，(-)黃皮酰胺也能增強(qiáng)突觸基礎(chǔ)傳遞和加強(qiáng)高頻電刺激引起的LTP的幅度，(+)黃皮酰胺和腦復(fù)康對(duì)LTP無(wú)影響。
本發(fā)明化合物可用口服方法或非腸胃道用藥。口服用藥可以是片劑、膠囊劑、包衣劑，非經(jīng)腸用藥劑型有注射劑和栓劑等。這些制劑是按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備的。為制造片劑、膠囊劑、包衣劑所用的輔料是常規(guī)用的助劑，例如淀粉，明膠，阿拉伯膠，硅石，聚乙二醇，液體劑型所用的溶劑例如有水，乙醇，丙二醇，植物油類(lèi)如玉米油，花生油，橄欖油等。含有本發(fā)明化合物的制劑中還可有其他助劑，例如表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑，防腐劑，矯味劑，色素等。
在片劑、膠囊劑、包衣劑，注射劑或栓劑中含有本發(fā)明通式(I)化合物的劑量是以單元?jiǎng)┬椭写嬖诘幕衔锪坑?jì)算的。
在上述工作基礎(chǔ)上，本發(fā)明人取得了新的進(jìn)展，基本闡明了(-)黃皮酰胺易化學(xué)習(xí)記憶和LTP的作用機(jī)制，觀察到(-)黃皮酰胺對(duì)β-amyloid(β-A)致記憶障礙的改善作用和抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是本發(fā)明方法的化學(xué)合成路線圖，其中，(+)2表示(+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯；(+)3表示(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羥基-苯乙基)-3-苯基縮水甘油酰胺；(+)4表示(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺；(-)5表示(-)黃皮酰胺酮；(-)-(3S，4R，5R)-3-羥基-5-苯甲酰甲基-1-甲基-4-苯基吡咯烷-2-酮；(-)I表示(-)黃皮酰胺；(-)-(3S，4R，5R，6S)-3-羥基-5-(a-羥基芐基)-1-甲基-4-苯基吡咯烷-2-酮。
圖2為四種典型的搜尋策略在Morris水迷宮訓(xùn)練中出現(xiàn)頻率的動(dòng)態(tài)變化圖。其中1，2，3，4，5，6和7分別代表對(duì)照組、模型組、模型加(-)黃皮酰胺8mg/kg治療組、模型(-)黃皮酰胺40mg/kg治療組、模型(+)黃皮酰胺8mg/kg治療組、模型(+)黃皮酰胺40mg/kg治療組、模型加腦復(fù)康400mg/kg治療組。
圖3為大鼠齒狀回苔狀神經(jīng)纖維發(fā)芽的區(qū)分布圖，其中A對(duì)照，B(-)黃皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黃皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黃皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黃皮酰胺40mg·kg-1與對(duì)照組比較，*P＜0.05及**P＜0.01。
圖4為大鼠海馬CA3區(qū)苔狀神經(jīng)纖維發(fā)芽的區(qū)分布圖，其中，A對(duì)照，B(-)黃皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黃皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黃皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黃皮酰胺40mg·kg-1與對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01。
圖5為BDNF蛋白在海馬錐體細(xì)胞和皮層細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的相對(duì)量的分布圖，其中，A對(duì)照，B(-)黃皮酰胺8mg·kg-1，C(-)黃皮酰胺40mg·kg-1，D(+)黃皮酰胺8mg·kg-1，E(+)黃皮酰胺40mg·kg-1。
圖中*及**表示與對(duì)照組比較，P＜0.05及**P＜0.01本文以下使用的字“孟”應(yīng)為具有草字頭的“孟”。
以下將結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但是非限定的目的。
實(shí)施例1 (+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸(+)-8-β-萘取代醇酯(2a)*將NaH(80％)430mg加入20ml干燥的THF中，N2保護(hù)下磁力攪拌，緩慢滴加1g苯甲醛和2.3g(+)-8-β-萘基醇氯乙酸酯(1a)*的10mlTHF溶液，加畢，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，將反應(yīng)液傾入30ml的冰水中(含1ml冰乙酸)，用乙醚(40ml×3)萃取，依次用飽和的NaHSO3水溶液，飽和NaHCO3水溶液，飽和NaCl水溶液洗滌，加無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，減壓濃縮至干，得2.9g油狀物。經(jīng)硅膠柱層析得2.16g白色固體。
收率79.0％，mp38～40C，[α]15D＝+35.8°(C1.31CHCl3)。NMR 500MHz，δ，ppm7.03-6.4(12H，m)，4.96(1H，td，J＝2.2Hz，10.7Hz)，3.96(1H，d，J＝1.27Hz)，2.64(1H，d，J＝1.2Hz)，1.48(3H，s)，0.98(3H，d，J＝6.48Hz)，0.9-2.2(9H，m)實(shí)施例2.(+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸(+)醇酯(2b)*
將NaH(80％)3.27g加入100ml無(wú)水THF中攪勻，滴加11.6g苯甲醛和11.85g氯乙酸(+)孟醇酯(1b)*的100ml無(wú)水THF溶液，加畢，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，抽濾，濾液減壓濃縮至干，加入適量乙醚溶解，依次用飽和NaHSO3水溶液，飽和NaHCO3水溶液，飽和NaCl水溶液洗至中性，加無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，所得油狀物冷凍固化，重結(jié)晶三次，得白色結(jié)晶7.62g。收率35％，mp62～63℃，[α]15D＝+167°(C1.0 CHCl3)。
實(shí)施例3 (+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*將4.28g化合物(2a*或2b*)溶于80ml甲醇，磁力攪拌，加入200mg甲醇鈉，反應(yīng)6小時(shí)后，滴加0.2ml冰乙酸，減壓濃縮干，加入100ml乙醚攪拌30分鐘過(guò)濾，減壓濃縮至干，得4.3g油狀物，經(jīng)硅膠柱層析，得1.33g油狀化合物(2)*。收率75％，[α]15D＝+170.9°(C1.33 CHCl3)。
實(shí)施例4(+)-2S.3R-N-甲基-N-(β-羥基苯乙基)-3-苯基縮水甘油酰胺(3)*將1.78g化合物(2)*，1.51g N-甲基-β-羥基苯乙胺分別溶于5ml甲醇中，冷卻至-20℃后混合，加入100mg甲醇鈉，溶解后冰箱中放置2天；滴加0.2ml2N鹽酸，減壓濃縮干，得白色固體，過(guò)濾得2.3g化合物(3)*。收率77.3％，mp93～94℃，[α]15D＝+70.2°(C0.684 CH3OH)。
實(shí)施例5(+)-2S.3R-N-甲基-N-α-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺(4)*將2.97g化合物(3)*，2.2g無(wú)水CuSO4和6.32g KMnO4依次加入到100mlCH2Cl2中攪拌3小時(shí)，過(guò)濾、用CH2Cl2洗、減壓濃縮干，得2.9g油狀物，重結(jié)晶，得2.3g化合物(4)*。收率78.0％，mp86～87℃，[α]15D＝+140.2°(C0.5CH3OH)。
實(shí)施例6(-)-黃皮酰胺酮的合成(5)*將2.95g化合物(4)*粉末加入到6.6mg LiOH·H2O的30ml水溶液中，于30～35℃水浴中磁力攪拌8小時(shí)，冷卻、過(guò)濾、干燥，重結(jié)晶，得1.5g化合物(5)*。收率50.8％，mp196～198℃，[α]15D＝-338°(C0.6 CH3OH)。
實(shí)施例7(-)-黃皮酰胺的合成(-)I將2.95g左旋化合物(5)*加入到200ml甲醇中，磁力攪拌溶解，加入1.52gNaBH4，反應(yīng)3小時(shí)；滴加1ml 2N鹽酸，減壓濃縮干，用CH2Cl2洗滌，加無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，減壓濃縮干，重結(jié)晶得2.4g化合物(I)*。收率80.8％，mp160～161℃，[α]15D＝-144°(C0.2 CH3OH)。
實(shí)施例8.經(jīng)消旋黃皮酰胺酮(±)5的拆分制備(-)黃皮酰胺(-)I將3g(-)醇氧乙酸溶于10g SOCl2中，加熱回流5小時(shí)，減壓蒸出SOCl2，加入5ml甲苯，再減壓蒸去甲苯，殘余物為棕色油狀物重3.5g，將其溶于50mlCH2Cl2，再投入2g消旋黃皮酰胺酮(±)5，冰浴冷卻，加入1ml無(wú)水吡啶，室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC顯示兩點(diǎn)，反應(yīng)物依次用2N鹽酸，飽和NaHCO3水溶液，飽和NaCl水溶液洗，無(wú)水Na2SO4干燥，得棕色固體5.4g，經(jīng)層離與重結(jié)晶，得兩種白色結(jié)晶(+7)*和(-7)*。
(+7)*0.86g，收率24.8％(理論收率50％)，mp152～153℃，[α]20D＝+156°(C1.1 CHCl3)；(-7)*1.06g，收率30.9％(理論收率50％)，mp177～178℃，[α]18D＝-249°(C0.21 CHCl3)。
分別以對(duì)甲苯磺酸作為催化劑在30ml甲醇中回流2小時(shí)，蒸去甲醇，有機(jī)層依次用稀鹽酸，稀堿水洗至中性，由(+7)*得(+)黃皮酰胺酮(+5)*，收率82％，mp193～194℃，[α]18D＝+339°(C0.21 CH3OH)。由(-7)*得(-)黃皮酰胺酮(-5)*，收率88％，mp193～194℃，[α]18D＝-340°(C0.22 CH3OH)。
將(-)黃皮酰胺酮(-5)*0.59g，按照實(shí)施例7相同的方法，以0.11gNaBH4還原，重結(jié)晶得0.5g(-)黃皮酰胺(I)*，收率83％，mp161～162℃，[α]18D＝-145°(C0.24 CH3OH)。具體制備流程如下 實(shí)施例9.經(jīng)消旋體黃皮酰胺酮(5)的拆分法制備(-)黃皮酰胺將3.56g(-)-S-鄰苯二甲酰丙氨酸，5g SOCl2加入到50ml甲苯中，加熱回流5小時(shí)，減壓蒸去SOCl2，再加入20ml甲苯，減壓濃縮至干，加入100ml干燥的CH2Cl2，用冰浴中冷卻至0℃以下，加入4g消旋黃皮酰胺酮(5)，磁力攪拌，滴加1.6g吡啶，加畢室溫?cái)嚢?0小時(shí)，加入30ml水，分取有機(jī)層，用30mlCH2Cl2萃取，合并有機(jī)相，依次用30ml 2N鹽酸，飽和NaHCO3水溶液，飽和NaCl水溶液洗，加無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，減壓濃縮干，重結(jié)晶，得(-6)*方晶1.42g，收率21.0％(理論量50％)，mp189～190℃，[α]15D＝-241°(C0.5 CHCl3)；(+6)*mp153～154℃，[α]15D＝+128.5°(C2.1 CHCl3)。
將4.96g方晶(-6)*加入到200ml甲醇中，磁力攪拌溶解，加入1.52g NaBH4，室溫反應(yīng)5小時(shí)，加入1ml 2N HCl，減壓濃縮干，重結(jié)晶，得(-)-黃皮酰胺+(I)2.38g，收率81％，mp161～163℃，[α]20D＝-144.4°(C0.46 CH3OH)。其具體制備流程如下 實(shí)施例10.真菌酶拆分方法制備(+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*將含有3％蔗糖，1％蛋白胨，0.5％磷酸二氫鉀，0.5％的聚乙二醇，1％的橄欖油30ml培養(yǎng)基置于250ml的燒瓶中，在120℃和一大氣壓下滅菌30分。冷卻后，向該培養(yǎng)基中接入一接種環(huán)的米曲霉(Aspergillus，sp)菌，30℃下，轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)40小時(shí)，將菌體離心分離。并將菌體加入至pH值為7的10ml含有150mg的β-苯基縮水甘油酸甲酯的磷酸鹽緩沖溶液中，30℃下反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入20ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥。濃縮得66mg油狀物。該油狀物經(jīng)手性氣相色譜分析(G-TA型手性柱，柱長(zhǎng)為l0米，氮?dú)鉃檩d氣，流速為2.5ml/min，爐溫為105℃)，其ee％值為98％，[α]D20＝+180°(c＝1，CHCl3)。
實(shí)施例11.放線菌拆分方法制備(+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*將含有1％蔗糖，2％蛋白胨，0.3％磷酸二氫鉀，1％的聚乙二醇，2％橄欖油，30ml的培養(yǎng)基置于250ml的燒瓶中，在120℃和一大氣壓下滅菌30分。冷卻后，向該培養(yǎng)基中接入一接種環(huán)的諾卡氏(Nocardia sp)菌，30℃，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)36小時(shí)，將菌體離心分離。并將菌體加入至pH值為7.5的10ml含有200mg的消旋β-苯基縮水甘油酸甲酯(2)的磷酸鹽緩沖溶液中，30℃下反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入20ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥。濃縮得80mg油狀物。該油狀物經(jīng)手性氣相色譜分析(G-TA型手性柱，柱長(zhǎng)為10米，氮?dú)鉃檩d氣，流速為2.5ml/min，爐溫為105℃)，其ee％值為98％，[α]D20＝+180°(C＝1 CHCl3)。
實(shí)施例12.酵母酶拆分方法制備(+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*將含有4％蔗糖，2％蛋白胨，1％磷酸二氫鉀，2％的聚乙二醇，1％橄欖油，30ml的培養(yǎng)基置于250ml的燒瓶中，在120℃和一大氣壓下滅菌30分。冷卻后，向該培養(yǎng)基中接入一接種環(huán)的假絲酵母(Candida sp)菌，30℃下轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)40小時(shí)，將菌體離心分離。并將菌體加入至pH值為8的30ml含有300mg的消旋β-苯基縮水甘油酸甲酯(2)的磷酸鹽緩沖溶液中，30℃反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入30ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥。濃縮得120mg油狀物。該油狀物經(jīng)手性氣相色譜分析(G-TA型手性柱，柱長(zhǎng)為10米，氮?dú)鉃檩d氣，流速為2.5ml/min，爐溫為105℃)，其de％值為98％，[α]D20＝+180°(c＝1，CHCl3)。
實(shí)施例13細(xì)菌酶拆分方法制備(+)-2S.3R-3-苯基縮甘油酸甲酯(2)*將含有2.5％檸檬酸鈉，1％大豆蛋白胨，0.5％磷酸二氫鉀，2.5％的聚乙二醇，1％橄欖油30ml的培養(yǎng)基置于250ml的燒瓶中，在120℃和一大氣壓下滅菌30分。冷卻后，向該培養(yǎng)基中接入一接種環(huán)的無(wú)色桿菌(Achromobacter.sp)，40℃下轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)40小時(shí)，將菌體離心分離。并將菌體加入至pH值為7的10ml含有150mg的消旋β-苯基縮水甘油酸甲酯(2)的磷酸鹽緩沖溶液中，30℃反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入20ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥。濃縮得66mg油狀物。該油狀物經(jīng)手性氣相色譜分析(G-TA型手性柱，柱長(zhǎng)為10米，氮?dú)鉃檩d氣，流速為2.5ml/min，爐溫為105℃)，其de％值為99％，[α]D20＝+181°(C＝1 CHCl3)。
實(shí)施例14細(xì)菌酶拆分方法制備(+)-2S，3R-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*將含有2％乳酸，1.5％硫酸胺，0.5％磷酸二氫鉀，0.5％的聚乙二醇，0.1％橄欖油30ml的培養(yǎng)基置于250ml的燒瓶中，在120℃和一大氣壓下滅菌30分。冷卻后，向該培養(yǎng)基中接入一接種環(huán)的芽孢桿菌(Bucillus.sp)，50℃下轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)40小時(shí)，將菌體離心分離。并將菌體加入至pH值為10的10ml含有150mg的消旋β-苯基縮水甘油酸甲酯(2)的磷酸鹽緩沖溶液中，50℃反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)完畢，加入20ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)層，并以飽和的亞硫酸氫鈉的水溶液洗滌，飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥。濃縮得66mg油狀物。該油狀物經(jīng)手性氣相色譜分析(G-TA型手性柱，柱長(zhǎng)為10米，氮?dú)鉃檩d氣，流速為2.5ml/min，爐溫為105℃)，其de％值為98％，[α]D20＝+181°(C＝1 CHCl3)。
實(shí)施例13 X-光晶體衍射法測(cè)定(-)-黃皮酰胺的絕對(duì)構(gòu)型為了確定(-)-黃皮酰胺的絕對(duì)構(gòu)型，采用實(shí)施例9中的化合物(-7)的單晶 由于(-)-蓋氧乙酸的絕對(duì)構(gòu)型是已知的，根據(jù)化合物(-7)的單晶X-光衍射測(cè)定結(jié)果，表明化合物(5)*的絕對(duì)構(gòu)型如下結(jié)構(gòu)式所示。
將(-)7化合物水解，經(jīng)硼氫化鈉還原得(-)-黃皮酰胺(-)I，根據(jù)由Sharpless還原方法所得黃皮酰胺旋光為(+)，構(gòu)型為3R*，4S*，5S*，6R*(+)I，且其絕對(duì)值與所得的(-)I相同，符號(hào)相反，熔點(diǎn)也-致，由此C6應(yīng)有6S的構(gòu)型，即(-)-黃皮酰胺(+)I應(yīng)具有3S，4R，5R，6S的構(gòu)型。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出(-)黃皮酰胺的促智活性至少是(±)黃皮酰胺的5倍，(+)黃皮酰胺就本發(fā)明的作用幾乎沒(méi)有生物活性；(-)黃皮酰胺不僅在行為學(xué)上，也在電生理方面證明它易化學(xué)習(xí)記憶和增強(qiáng)神經(jīng)可塑性的作用；(-)黃皮酰胺不但有很強(qiáng)的促智作用，并具有潛在的防治老年癡呆作用，它表現(xiàn)在抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及抑制Tau蛋白過(guò)磷酸化；除了已經(jīng)從生化學(xué)，分子生物學(xué)和形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面闡明(-)黃皮酰胺的促智作用機(jī)制以外，特別是在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面證明它可以刺激海馬苔狀神經(jīng)末梢的發(fā)芽；經(jīng)對(duì)(-)(+)黃皮酰胺的研究，證明其代謝產(chǎn)物也有生物活性。實(shí)驗(yàn)例1(-)黃皮酰胺增強(qiáng)大鼠海馬齒狀回突觸傳遞活動(dòng)的機(jī)制采用麻醉大鼠，將刺激電極埋藏于內(nèi)嗅區(qū)前穿質(zhì)通路，記錄電極埋藏于海馬齒狀回(DG)顆粒細(xì)胞層，以群峰電位(PS)作為DG顆粒細(xì)胞群興奮性的指標(biāo)，LTP是由10串200Hz的高頻電刺激所誘導(dǎo)，每串刺激由5個(gè)波寬0.2ms的方波刺激組成，(-)、(+)黃皮酰胺和相應(yīng)濃度的助溶劑DMSO都是通過(guò)植入側(cè)腦室的簍管給予，記錄30min的PS代表給藥前的基礎(chǔ)突觸傳遞水平，然后于5分鐘內(nèi)將5μl的相應(yīng)藥物或助溶劑緩慢注入側(cè)腦室。
1.研究證明，在麻醉大鼠DG部位用200Hz高頻刺激誘導(dǎo)出一種NMDA受體和VDCC依賴性的LTP。(-)黃皮酰胺增強(qiáng)麻醉大鼠海馬DG突觸傳遞過(guò)程是VDCC依賴性的而與NMDA受體無(wú)關(guān)，高頻刺激誘導(dǎo)的LTP和(-)黃皮酰胺增強(qiáng)的突觸傳遞活動(dòng)都伴有海馬依賴性的蛋白磷酸酶Calcineurin和Calpain活性的提高，(參見(jiàn)下表1和表2)提示參與LTP和(-)黃皮酰胺對(duì)突觸傳遞活動(dòng)增強(qiáng)作用的不僅是蛋白激酶，而且有蛋白磷酸酶，說(shuō)明蛋白磷酸化和脫磷酸化過(guò)程都有所增強(qiáng)，可能是由這兩個(gè)過(guò)程最后相互協(xié)調(diào)和互為補(bǔ)充的結(jié)果決定突觸水平的高低。
表1.大鼠皮層和海馬組織的Calcineurin活性組 別 Calcineurin活性(umol Pi/hr/μg蛋白)腦皮層海馬對(duì)照 8.3±0.4 7.8±0.6AP5 7.9±0.7 8.1±0.7尼莫地平 8.4±0.5 7.7±0.8高頻電刺激(HFS) 9.2±1.1 8.5±0.7APS+HFS 8.8±0.7 9.6±0.5*尼莫地平+HFS 7.7±1.4 9.8±0.4*APS+尼莫地平+HFS 8.0±0.9 7.9±0.7(-)黃皮酰胺 11.2±0.9*10.4±0.5*(-)黃皮酰胺+APS 11.6±1.4*10.1±0.8*(-)黃皮酰胺+尼莫地平 9.1±1.2 8.3±0.6*與對(duì)照組比較，P＜0.05表2.大鼠皮層和海馬組織的Calpain活性組 別 Calpain(ΔA595nm/hr/mg蛋白)腦皮層 海馬對(duì)照 1.5±0.27.8±0.6AP51.6±0.41.6±0.6尼莫地平 1.7±0.31.8±0.5HFS1.8±0.74.3±0.7**APS+HFS1.7±0.42.9±0.8*#尼莫地平+HFS 1.8±0.52.6±0.7*#APS+尼莫地平+HFS 1.7±0.41.8±0.6(-)黃皮酰胺2.6±0.5*2.7±0.8*APS+(-)黃皮酰胺2.7±0.6*2.6±0.7*尼莫地平+(-)黃皮酰胺 1.6±0.61.9±0.6*及**表示與對(duì)照組相比，P＜0.05及P＜0.01#與HFS組相比P＜0.05。
2.研究證明，正常成年大鼠海馬CA3區(qū)和DG存在少量苔狀纖維末稍出芽現(xiàn)象。(-)黃皮酰胺8mg·kg-1和40mg·kg-1劑量依賴性地促進(jìn)這兩個(gè)海馬區(qū)域的苔狀纖維末梢的出芽，而同劑量(+)黃皮酰胺卻對(duì)其沒(méi)有明顯的影響，提示(-)、(+)黃皮酰胺這種作用的明顯差異可能是其長(zhǎng)期給藥對(duì)海馬突觸傳遞不同影響的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)(結(jié)果列于圖3、圖4)3. BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)大量地在正常大鼠皮層神經(jīng)元和海馬顆粒細(xì)胞和錐體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，(-)黃皮酰胺(8，40mg·kg-1)劑量依賴性增加BDNF在這兩個(gè)區(qū)域的表達(dá)，(+)黃皮酰胺(40mg·kg-1)對(duì)其也有輕度增加作用，提示(-)(+)黃皮酰胺長(zhǎng)期給藥對(duì)海馬突觸傳遞活動(dòng)的不同影響可能與其對(duì)BDNF蛋白表達(dá)的作用差異有關(guān)。結(jié)果見(jiàn)圖54.谷氨酸受體在(-)黃皮酰胺致LTP中的作用。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，它從突觸前釋放，激活突觸后多種谷氨酸受體，在LTP中占有重要地位，G蛋白偶聯(lián)性受體mGluR不直接調(diào)節(jié)電信號(hào)，而是激活多種第二信使級(jí)聯(lián)反應(yīng)。我們觀察了mGluR拮抗劑(±)MCPG對(duì)(-)黃皮酰胺誘發(fā)在體海馬齒狀回LTP的影響，結(jié)果表明，(±)MCPG(10μmol，icv)抑制HFS和(-)黃皮酰胺誘導(dǎo)的LTP，在給予HFS和(-)黃皮酰胺后15min側(cè)腦室注射(±)MCPG可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)建立的LTP，提示MCPG敏感的mGluR受體是(-)黃皮酰胺誘導(dǎo)和維持LTP所必須的，(-)黃皮酰胺通過(guò)mGluR受體引起突觸傳遞功能增強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)例2(-)和(+)黃皮酰胺對(duì)β-A致記憶障礙的改善作用老年斑是早老性癡呆癥患者的主要神經(jīng)病理特征。其核心成分是一種由40-42個(gè)氨基酸組成的多肽，這種被稱(chēng)為β-淀粉樣蛋白(β-A)的多肽已被大量的研究證實(shí)其具有神經(jīng)毒性作用。β-A結(jié)構(gòu)中一個(gè)由11個(gè)氨其酸(25-35)組成的片斷β-A(25-35)具有與β-A相似的神經(jīng)毒性作用和自我凝聚能力，跟β-A一樣，凝聚態(tài)β-A(25-35)的神經(jīng)毒性較其溶解態(tài)強(qiáng)，利用向大鼠側(cè)腦室注射凝聚態(tài)β-A(25-35)成功地造成了動(dòng)物在Morris水迷宮中的記憶障礙模型。
腦室內(nèi)注射15nmolβ-A(25-35)后第15天開(kāi)始采用Morris水迷宮訓(xùn)練測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，每天訓(xùn)練4次，每次3min。結(jié)果以動(dòng)物找到平臺(tái)所需的時(shí)間即潛伏期，朝向錯(cuò)誤角度(動(dòng)物軀體長(zhǎng)軸所指方向與入水點(diǎn)到平臺(tái)間連線的夾角)和動(dòng)物尋找平臺(tái)所采用的策略來(lái)表示。
訓(xùn)練的第2天開(kāi)始，β-A(25-35)模型組的潛伏期明顯比對(duì)照組長(zhǎng)(F＝3.04，P＜0.05)至第5天，差別最顯著(F＝13.7，P＜0.01)。從第3天開(kāi)始，(-)黃皮酰胺8mg·kg-1組和40mg·kg-1組的潛伏期比β-A(25-35)模型組明顯縮短(F＝2.68，P＜0.05和F＝2.73，P＜0.05)。(+)黃皮酰胺8和40mg·kg-1組和腦復(fù)康400mg·kg-1組訓(xùn)練各天的潛伏期與β-A(25-35)模型組沒(méi)有顯著差異。各組動(dòng)物的錯(cuò)誤朝向角度隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加逐漸減小，從第3天開(kāi)始模型組的錯(cuò)誤朝向角度明顯大于對(duì)照組，(-)黃皮酰胺8mg·kg-1和40mg·kg-1組明顯小于模型組。同劑量的(+)黃皮酰胺8mg·kg-1和400mg·kg-1腦復(fù)康組與模型組間無(wú)顯著性差異。(見(jiàn)表3)表3.β-AP(25-35)對(duì)Morris水迷宮訓(xùn)練中朝向錯(cuò)誤角度的影響及(-)、(+)黃皮酰胺的作用。朝向錯(cuò)誤角度以MEAN±S.D.表示。組別 訓(xùn)練天數(shù)1 23 4 5A93.6±34.6 76.8±29.847.3±15.129.6±10.7 15.4±20.4B106.3±29.898.7±30.473.5±20.3*60.6±23.8*46.7±19.4*C89.7±29.4 72.3±19.846.5±21.2# 30.4±14.8#17.6±9.5#D101.5±24.383.5±21.851.2±18.7# 28.4±13.2#20.7±8.7#E99.4±31.7 93.5±29.682.1±26.770.2±21.5 59.2±18.3F112.4±32.8102.5±28.7 94.2±22.583.1±26.5 65.4±20.8G92.5±28.9 87.3±24.274.6±23.762.5±19.6 44.5±14.3*P＜0.05vs對(duì)照組#P＜0.05vs模型組。A對(duì)照組B模型組C模型(-)黃皮酰胺8mg/kg治療組D模型(-)黃皮酰胺40mg/kg治療組E模型(+)黃皮酰胺8mg/kg治療組F模型(+)黃皮酰胺40mg/kg治療組G模型腦復(fù)康400mg/kg治療組。
本實(shí)驗(yàn)中大鼠四種典型的搜索站臺(tái)的方式隨機(jī)式，邊緣式，趨向式和直線式都觀察到了。在訓(xùn)練開(kāi)始時(shí)各組動(dòng)物都主要以邊緣式和隨機(jī)式策略尋找站臺(tái)，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，這兩種搜索策略的出現(xiàn)率逐漸下降。從第三天開(kāi)始，正常對(duì)照組和(-)黃皮酰胺治療組這種下降的速度和程度較其它組快。同時(shí)，趨勢(shì)向式和直線式的出現(xiàn)逐漸增加。其結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2。實(shí)驗(yàn)例3(-)黃皮酰胺對(duì)Baxc DNA高表達(dá)的PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用1、首次建成Baxα穩(wěn)定表達(dá)的PC12細(xì)胞系首先用限制性內(nèi)切酶去除了BaxαcDNA3’末端加PolyA信號(hào)序列及部分其它序列，構(gòu)建了中間載體Pbluescript SK-Baxα(PA)然后用內(nèi)切酶從中間載體將BaxαcDNA切出，以單一方向與真核表達(dá)載體PcDNA3相連接獲得PcDNA3 Baxα重組質(zhì)粒。序列重組的Baxα cDNA含有-50bp的5’非翻譯末端(5’-UTR)，576bp的開(kāi)放讀碼框架(ORF)以及137bp的3’非翻譯末端(3’-UTR)。用lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3-Baxα轉(zhuǎn)入PC12細(xì)胞，用G-418選擇抗性細(xì)胞克隆。Western印跡法和免疫組織化學(xué)法都顯示PC-12細(xì)胞系內(nèi)有Baxα蛋白高水平的表達(dá)，故本研究成功地首次建立了Baxα穩(wěn)定表達(dá)的PC12細(xì)胞素。
2、Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞系凋亡模型的建立及(一)黃皮酰胺的抗細(xì)胞凋亡作用原位末端標(biāo)記(TUNEL)和流式細(xì)胞儀觀察表明6-羥基多巴胺(6-OHDA)100μmol/L可以誘導(dǎo)Baxα高表達(dá)PC-12細(xì)胞系的凋亡損傷，與轉(zhuǎn)空載細(xì)胞相比較凋亡的比例明顯上升(49.96％vs32.9％)，說(shuō)明Baxα在凋亡過(guò)程中起重要作用，給予(-)黃皮酰胺10-7～10-5mol/L后可使細(xì)胞凋亡比例從49.96％分別下降到36。23％，28.1％和9.5％。
3、(-)黃皮酰胺抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究(1)Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA誘導(dǎo)后24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2抗細(xì)胞凋亡基因的水平有一定程度下降，給予(-)黃皮酰胺10-7和10-6/mol/L后，可使Bcl-2蛋白的水平明顯升高。
(2)Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA作用后24小時(shí)，線粒體內(nèi)GSH的含量明顯降低(9.84±1.20 vs 14.98±1.18n mol/mg pro)，MDA的含量明顯升高(2.46±0.19 vs 2.01±0.12n mol/mg pro)給予(-)黃皮酰胺10-710-610-5mol/L后可使線粒體內(nèi)GSH的含量顯著升高(12.29±0.99，15.10±0.95，17.78±1.04nmol/mg pro)MDA的含量明顯下降(1.76±0.17，1.54±0.13，1.33±0.11n mol/mg
Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞與轉(zhuǎn)空載細(xì)胞相比較具有較高的線粒體膜電位(95.08VS 83.03)。經(jīng)6-OHDA誘導(dǎo)后12小時(shí)，Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞的線粒體膜電位明顯降低(95.08 vs 24.6)給予(-)黃皮酰胺10-7和10-6mol/L后可以使線粒體膜電位明顯升高(30.7±3.3，56.0±5.0)。另外，Baxα高表達(dá)PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA誘導(dǎo)后12小時(shí)，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合酶I的活性顯著降低(1.44±0.16 vs 1.68±0.14μmol/mg pro/min)，復(fù)合酶IV的活性也顯著降低(0.09±0.019 vs 0.15±0.022μmol/mg pro/min)。給予(一)黃皮酰胺10-7，10-6，10-5mol/L后，可使線粒體電子傳遞鏈復(fù)合酶I活性升高(1.57±0.12，1.98±0.05，2.16±0.2μmol/mgpro/min)。以及使復(fù)合酶IV活性升高(0.12±0.015，0.15±0.02，0.18±0.01μmol/mgpro/min)。
(4)(一)黃皮酰胺對(duì)體外分離線粒體細(xì)胞色素C釋放的影響細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)的刺激后，細(xì)胞色素C進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)激活死亡程序，本研究首先用固相金屬離子純化法分離得到Baxα蛋白，當(dāng)將其加入到分離的線粒體后，可使線粒體細(xì)胞色素C含量減少(74.43±5.69μg/mg pro.vs 50.2±30.65μg/mg pro)，(一)黃皮酰胺10-7，10-6，10-5mol/L可使細(xì)胞色素C釋放分別降低為58.73±3.77，61.7±5.3和67.95±7.6μg/mg pro。
實(shí)驗(yàn)例4(±)、(-)、(+)黃皮酰胺改善記憶作用的比較本發(fā)明采用一次性回避條件反射跳臺(tái)法和避暗法以多次學(xué)習(xí)的水迷宮法觀察(±)、(-)、(+)黃皮酰胺對(duì)改善記憶的作用進(jìn)行了比較性試驗(yàn)。
跳臺(tái)法和避暗法系于實(shí)驗(yàn)前口服藥物一次。水迷宮法共實(shí)驗(yàn)5天，每天訓(xùn)練前腹腔注射藥物一次，連續(xù)5天，結(jié)果以潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)表示。
表4為腦復(fù)康和(-)黃皮酰胺對(duì)跳臺(tái)法和避暗法因注射樟柳堿引起記憶獲得障礙的作用。
表4
N＝10x±SD**＜0.05***P＜0.01 VS 0.9％Nacl(樟柳堿)表5為腦復(fù)康和(-)、(±)黃皮酰胺對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)記憶潛伏期和記憶過(guò)程的影響。
表5藥物劑量mg/kg第二天 第三天 第四天達(dá)到平臺(tái)的潛伏 達(dá)到平臺(tái)的潛伏期(秒) 期(秒)0.9％Nacl 32.4±29.225.8±18.4 26.1±38.4腦復(fù)康 50032.2±22.618.6±9.9**16.7±16.3**(-)黃皮酰胺 10 28.7±35.217.4±10.9**12.1±6.9**(±)黃皮酰胺10 35.8±35.223.9±22.6 17.1±14.3(±)黃皮酰胺10036.6±37.025.7±13.8 14.6±10.4**N＝10，x±SD**P＜0.05***P＜0.01 VS 0.9％Nacl表6為腦復(fù)康、(-)、(±)黃皮酰胺對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)中因注射樟柳堿(10mg/kg)引起記憶獲得障礙的作用。表6藥物 N劑量(mg/kg) 錯(cuò)誤次數(shù)樟柳堿 1015.9±11.3腦復(fù)康 9500 23.5±25.0(-)黃皮酰胺 10 10 9.4±5.9**(±)黃皮酰胺 810 16.6±23.9(±)黃皮酰胺 8100 9.11±3.8****P＜0.05 VS樟柳堿組表7為(-)、(+)黃皮酰胺對(duì)避暗實(shí)驗(yàn)中樟柳堿引起記憶獲得障礙的作用表7藥物 劑量(mg/kg) 潛伏期(秒) 錯(cuò)誤次數(shù)0.9％Nacl 152.1±64.2 2.0±3.8樟柳堿 10 35.8±76.4**14.1±8.9**(+)黃皮酰胺 10 138.2±86.7**6.7±11.0*(-)黃皮酰胺 50 140.6±96.4**5.4±4.1**(±)黃皮酰胺 10 43.0±65.8 11.3±21.5(±)黃皮酰胺 50 79.9±63.6 14.4±12.3*P＜0.05**P＜0.01 VS樟柳堿組**P＜0.01 VS 0.9％Nacl組(-)、(+)黃皮酰胺于訓(xùn)練前30分鐘灌喂給藥。樟柳堿組于訓(xùn)練前10分鐘腹腔注射給藥。
權(quán)利要求
1.一種制備具有如通式I所示的光活化合物(-)黃皮酰胺或其衍生物的方法，通式(I)所示的結(jié)構(gòu)，其絕對(duì)構(gòu)型為(3S，4R，5R，6S)，具有左旋光性，其中R1及R2可以是H、鹵素、C1-6的烷基、 烷氧基、次甲二氧基、硝基；也可以是多取代R1和R2可以相同，也可以不同。R1，R2＝H時(shí)，為(-)黃皮酰胺，包括以下步驟(1)以氯乙酰氯與手性醇R*OH形成手性醇的氯乙酸酯(1)*；(2)得到的手性醇的氯乙酸酯與苯甲醛或R1取代的苯甲醛反應(yīng)，獲得相應(yīng)光活的芳基縮甘油酸手性醇酯(2a)*、(2b)*(3)經(jīng)酯交換得(+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*，(4)得到的+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*與相應(yīng)的胺縮合得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-(β-羥基-苯乙基)-3-苯基縮水甘油酰胺(3)*，再經(jīng)氧化得(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺(4)*；(5)所述的(+)-(2S，3R)-N-甲基-N-苯甲酰甲基-3-苯基縮水甘油酰胺(4)*在堿性條件下環(huán)合得光活(-)黃皮酰胺酮(5)*(6)光活黃皮酰胺酮(5)*經(jīng)硼氫化鈉還原可得光活黃皮酰胺或其衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的所述的手性醇包括(+)薄荷醇、(+)8苯基薄荷醇或者(+)8β萘基薄荷醇。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于環(huán)合所用的堿包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、二異丙胺基鋰，丁基鋰，四烷基氫氧化胺及三烷基胺。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于環(huán)合時(shí)使用的溶劑為水、甲醇、乙醇等低烷基醇或它們的混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于可以利用消旋黃皮酰胺酮化合物(5)的C3位的羥基與拆分劑手性酸成酯，然后經(jīng)重結(jié)晶或?qū)游龇蛛x所得一對(duì)差向異構(gòu)體，所述的拆分劑手性酸包括L孟氧乙酸，樟腦磺酸、(-)S鄰苯二甲酰丙氨酸或者N-對(duì)甲苯磺酰脯氨酸，優(yōu)選的是(-)S鄰苯二甲酰丙氨酸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于可以將消旋的3-苯基縮水甘油酸甲酯經(jīng)酶拆分的方法制得(+)-(2S，3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯(2)*，其中，采用具有產(chǎn)生水解酶能力的選自真菌，細(xì)菌，酵母，和放線菌的微生物在培養(yǎng)基中，溫度為10-50℃，優(yōu)選為20～40℃下有氧發(fā)酵對(duì)化合物(+)β-苯基縮水甘油酸甲酯進(jìn)行立體選擇性水解反應(yīng)，其水解反應(yīng)的pH值介于5～10之間，溫度為10-50℃，分離萃取得到光活性黃皮酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的具有產(chǎn)生水解酶的能力的微生物包括無(wú)色桿菌(Achromobacter，sp)，產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes，sp)，節(jié)桿菌(Archrobacter，sp)，芽孢桿菌(Bacillus sp)，短桿菌(Breubacillus，sp)，棒桿菌(Corynebacterium，sp)，歐文氏菌(Erwinia sp)，假單孢菌(Pseudomonas sp)屬，酵母的假絲酵母(Candida sp)和畢赤(Pichia sp)，紅酵母(Rhadatorula sp)，漢蓀酵母(Hansenula sp)屬，真菌中的曲霉(Aspergillus)，毛霉(Mucorsp)，米曲霉(Aspergillus，sp)，青霉(Penicillium)，根霉(Rhizopus sp)以及放線菌中的諾卡氏(Nocardia sp)，鏈霉菌(Streptomyces sp)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的立體選擇性水解反應(yīng)中，底物的濃度可以控制在0.05～10％之間，最好為0.5～5％，pH為5～11，最好為6～9。
9.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于可以在培養(yǎng)基中加入表面活性劑，以增大底物在緩沖溶液中的溶解度，表面活性劑包括聚乙二醇、吐溫、聚乙烯醇、十六烷基三甲基溴化銨，表面活性劑的濃度控制在0.05～5％，優(yōu)選為0.5～2％。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在所述的立體選擇性水解反應(yīng)可以在緩沖液和有機(jī)溶劑中兩相中進(jìn)行，所述的有機(jī)溶劑包括苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、異丙醚、四氯化碳、氯仿，優(yōu)選是甲苯或二甲苯或異丙醚。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在所述的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、鄰苯二甲酸緩沖液、酒石酸緩沖液、二乙基巴比妥酸鈉緩沖液、2，4，6-三甲基吡啶-鹽酸緩沖液、2-氨基-2-羥甲基-(1，3)丙二醇-鹽酸緩沖液，檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和N-乙基嗎啉-鹽酸緩沖液。
12.如權(quán)利要求1所述的光學(xué)活性化合物(-)黃皮酰胺在制備促智，抗衰老作用藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種制備光活(－)黃皮酰胺或其衍生物的方法,以氯乙酰氯與手性醇R
文檔編號(hào)C07D207/273GK1345721SQ00124630
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月28日
發(fā)明者黃量, 張均田, 吳克美, 孫萬(wàn)儒 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所