本發(fā)明涉及一種可溶性表達(dá)量提高的短小芽胞桿菌cota漆酶突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

漆酶(laccase，e.c.1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類(lèi)物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，在木質(zhì)素及其前體類(lèi)似物的生物降解中發(fā)揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣泛，包括酚類(lèi)及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶應(yīng)用潛力巨大。在木材加工領(lǐng)域，漆酶能代替化學(xué)膠合劑，不但能提高產(chǎn)品質(zhì)量，而且能減輕對(duì)人體健康的傷害及對(duì)環(huán)境的污染；在造紙工業(yè)中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙廠的污染，有助于造紙業(yè)最終實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)；在食品加工領(lǐng)域，漆酶可用于除去果汁中酚類(lèi)化合物引起的混濁，從而提高果汁的質(zhì)量。此外，漆酶還可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，減少以氯酚類(lèi)為工業(yè)原料生產(chǎn)染料、防腐劑、除草劑、殺蟲(chóng)劑等化工產(chǎn)品而造成的環(huán)境污染。

漆酶按來(lái)源不同可分為四大類(lèi)：植物漆酶、昆蟲(chóng)漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。植物漆酶主要由漆樹(shù)漆液分離而得。真菌漆酶來(lái)源更為廣泛(存在于多種擔(dān)子菌中)，具單電子氧化還原電位高、催化活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，既能催化底物的氧化聚合又能對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行催化降解，是一直以來(lái)人們重點(diǎn)研究的漆酶種類(lèi)。細(xì)菌漆酶則發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，最初是1993年由givaμdan等人首先在一種生脂固氮螺菌中鑒定出來(lái)的。隨后，科研人員又陸續(xù)在交替單胞菌、大腸桿菌、假單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、球形芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、極端耐堿芽胞桿菌、灰色鏈霉菌等細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了不同種類(lèi)的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽胞桿菌的cota蛋白、海單胞菌的ppoa蛋白、大腸桿菌的cμeo蛋白、灰色鏈霉菌的epoa蛋白等，這些細(xì)菌漆酶與真菌漆酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)。在這些漆酶中，cota漆酶最受研究者關(guān)注，其中枯草芽胞桿菌cota漆酶的研究最多，最深入。

由于真菌來(lái)源漆酶在工作環(huán)境ph偏堿性時(shí)活性非常低或幾乎沒(méi)有，熱穩(wěn)定性也較差，且絲狀真菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基要求高，菌絲在發(fā)酵罐中易受到高剪切力的損傷，這大大限制了真菌漆酶在工業(yè)上的應(yīng)用。研究揭示，細(xì)菌來(lái)源漆酶雖氧化活性普遍略低于真菌來(lái)源漆酶，然而它們往往具有一些自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：如無(wú)需糖基化修飾、熱穩(wěn)定性好、酶活性的最適ph范圍廣等，這些性質(zhì)正是目前漆酶工業(yè)應(yīng)用所急需的。然而細(xì)菌漆酶本身的表達(dá)量較真菌漆酶要低，且在大腸桿菌中易形成包涵體，包涵體的復(fù)性比較困難，耗費(fèi)物力財(cái)力。近些年，定點(diǎn)突變技術(shù)被運(yùn)用到提高蛋白的可溶性表達(dá)上，并取得良好效果，漆酶可溶性表達(dá)量的增加，將有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。

我國(guó)每年印染廢水排放量占總工業(yè)廢水排放量的35％，己成為危害最大的重要污染源，大部分合成染料都難以被微生物降解。這些染料化合物通常被用于紡織、食品、塑膠和生物醫(yī)學(xué)的著色劑，每年全世界商用染料使用達(dá)7×10⁵噸，種類(lèi)達(dá)1×10⁴種，其中5～10％的染料都以工業(yè)污水形式排放出來(lái)。有色污水直接釋放到環(huán)境中，許多染料在厭氧環(huán)境下可能轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)或致癌物質(zhì)，眾多國(guó)家相繼都頒布了嚴(yán)厲的法規(guī)來(lái)限制工業(yè)染料污水的排放。由于染料自身特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用物理或化學(xué)法(凝結(jié)、臭氧、活性炭)處理往往效果不佳，且還易造成二次污染。研究表明，生物法(使用漆酶、錳過(guò)氧化物酶等)具有脫色率高、運(yùn)行成本低、綠色環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，是處理印染廢水的潛在有效手段，是當(dāng)前印染廢水脫色研究的熱點(diǎn)。絕大多數(shù)排放的工業(yè)印染污水往往溫度很高且ph值偏堿。在各類(lèi)來(lái)源的漆酶中，真菌漆酶由于只在ph偏酸環(huán)境下具有較好的脫色效果，在偏堿性條件下難以發(fā)揮作用，且耐熱溫度低于細(xì)菌漆酶，所以細(xì)菌漆酶憑借其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在工業(yè)印染廢水處理中更具應(yīng)用潛力。

因此，挖掘能耐受高溫和高ph值(耐堿)條件的細(xì)菌漆酶基因并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)具有重要研究意義和應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室研究并報(bào)道了一種活性提高的短小芽胞桿菌cota漆酶突變體(wlf)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改造獲得一株性能穩(wěn)定，可溶性表達(dá)量提高的重組突變體d501g/wlf。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種性能優(yōu)良，可溶性表達(dá)量提高的漆酶突變體d501g/wlf。該突變體以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的催化活性大大提高的突變體wlf為模板，進(jìn)一步將wlf的第501位極性帶負(fù)電荷的天冬氨酸(asp，d)突變?yōu)闃O性不帶電荷的甘氨酸(gly，g)，以野生型b.pumilusw3cota(wt)和wlfcota作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其可溶性表達(dá)量增加，并且酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

所述b.pumilusw3cota漆酶的原始親本氨基酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的b.pumilusw3cota漆酶氨基酸序列一致(本實(shí)驗(yàn)室提交，genbank登錄號(hào)：kf040050)。

所述短小芽孢桿菌漆酶突變體d501g/wlf第501位天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，核苷酸序列如seqidno.1，其氨基酸序列如seqidno.2。

本發(fā)明還提供一種獲得所述漆酶突變體的方法，其特征在于，首先通過(guò)序列比對(duì)確定501位突變位點(diǎn)，然后以pcoldⅱ-cota(wlf)質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)pcr進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到含有突變后的重組質(zhì)粒pcoldⅱ-cota(d501g/wlf)，轉(zhuǎn)dmt感受態(tài)(購(gòu)于transgen公司)，菌落pcr驗(yàn)證，保存甘油管并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的菌活化、提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)e.colibl21(de3)感受態(tài)，并進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，將基因大小正確的菌株-80℃保藏甘油管。

本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)上述d501g/wlf可溶性漆酶的方法，將構(gòu)建好的保藏在甘油管中的目的菌株接3mllb試管活化，37℃200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，取1ml活化的菌液接種到含有50ml培養(yǎng)基的搖瓶，培養(yǎng)2-3個(gè)小時(shí)(od≈0.5)，搖床調(diào)至15℃靜止培養(yǎng)30min，接著加入終濃度為0.4mm的iptg和0.25mm的cuso4在15℃200rpm的搖床中誘導(dǎo)表達(dá)24h。收集發(fā)酵液，4℃8000rpm離心10min，棄上清，用ph7.0磷酸緩沖液重懸，超聲破碎，可得漆酶上清液。由于重組表達(dá)的cota漆酶蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽(his6·tag)，因此使用鎳離子親和層析法分離目標(biāo)蛋白。利用aktaavant25蛋白純化系統(tǒng)經(jīng)過(guò)平衡、上樣、洗脫等步驟，最終可得到純化的cota漆酶。

附圖說(shuō)明

圖1為細(xì)菌漆酶和真菌漆酶c-末端序列比對(duì)圖。

圖2為定點(diǎn)突變?cè)硎疽鈭D。

圖3為b.pumilusw3cota漆酶的大腸桿菌重組表達(dá)、純化的sds-page圖譜；其中m：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)；1：wlf上清；2：d501g/wlf上清；3：wt純化；4：wlf純化；5：d501g/wlf純化。

圖4為b.pumilusw3cota重組漆酶和漆酶突變體的最適反應(yīng)ph(a)和ph穩(wěn)定性(b)分析。

圖5為b.pumilusw3cota重組漆酶和漆酶突變體的最適反應(yīng)溫度(a)和溫度穩(wěn)定性(b、c、d)分析。

圖6為b.pumilusw3cota重組漆酶和漆酶突變體高鹽濃度下穩(wěn)定性分析。

圖7為b.pumilusw3cota重組漆酶和漆酶突變體以乙酰丁香酮為介體在堿性條件下對(duì)1種偶氮、1種蒽醌、2種三苯甲烷和一種芳香族雜環(huán)染料的脫色作用。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

材料和試劑：abts、氨芐青霉素等購(gòu)于sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)于北京全式金公司；其他試劑均為國(guó)內(nèi)或者國(guó)外購(gòu)買(mǎi)的分析純?cè)噭?；大腸桿菌bl21(de3)菌株購(gòu)于中國(guó)takara寶生物公司等。

實(shí)施例1b.pumilusw3漆酶突變體的構(gòu)建

定點(diǎn)突變?cè)恚狐c(diǎn)突變?cè)聿捎靡镆胪蛔兾稽c(diǎn)，pcrsμpermix合成突變鏈(圖2)。以前期構(gòu)建成功的重組漆酶突變體wlf的cota漆酶基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物，將漆酶中第501位天冬氨酸(asp，d)突變?yōu)楦拾彼?gly，d)。設(shè)計(jì)的相關(guān)正向引物和反向引物如下：

前引f5’-aacacgaggattatggcatgatgcggcc-3’

后引r5’-ccataatcctcgtgttctaatatgtgac-3’

其中下劃線部分分別代表突變體基因編碼的501位甘氨酸所對(duì)應(yīng)的密碼子。pcr擴(kuò)增體系為：質(zhì)粒dna3μl，前引(10μm)1μl，后引(10μm)1μl，pcrsμpermix25μl，ddh2o補(bǔ)至50μl，pcr擴(kuò)增條件為94℃變性4min，循環(huán)25次(94℃20s，55℃20s，72℃3min)，最后72℃延伸10min。取5μlpcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并檢測(cè)到目的條帶正確。將1μldmt酶加入剩余的pcr產(chǎn)物中，混勻，37℃孵育1小時(shí)，加入3μldmt酶消化產(chǎn)物于100μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30分鐘。42℃水浴熱擊45s，立即置于冰上2min；然后加900μl平衡至室溫的lb培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)1h，最后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mgl^-1氨芐青霉素的lb平板，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)，從平板上挑選10個(gè)單菌落進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，從驗(yàn)證成功的菌落中挑5個(gè)單菌落接種到lb液體培養(yǎng)基，10h后將每個(gè)單菌落保存2個(gè)甘油管，一份-80℃保藏，一份用于測(cè)序。將測(cè)序正確的突變體從甘油管接種到lb液體培養(yǎng)基中過(guò)夜活化，之后先保存甘油管，然后剩余菌液提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。

實(shí)施例2b.pumilusw3漆酶的表達(dá)與純化

表達(dá)：從甘油管中接種野生型重組漆酶表達(dá)菌株和前期構(gòu)建的wlf和d501g/wlf重組表達(dá)菌株到lb培養(yǎng)基中活化，37℃，200rpm過(guò)夜(10h)。按2％接種量分別將種子接入50mllb液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含100mgl^-1氨芐青霉素)37℃200rpm搖床培養(yǎng)至od600達(dá)到0.5，然后搖床溫度調(diào)至15℃靜止培養(yǎng)30min，接著加入終濃度0.4mmiptg和0.25mmcuso4進(jìn)行誘導(dǎo)，15℃200rpm培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液于4℃8000rpm離心10min去除上清，收集菌體。將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液重懸，重懸后用超聲波細(xì)胞破碎儀將菌體破碎釋放胞內(nèi)蛋白，破碎完成后，將破碎的液體離心20min(4℃、8000rpm)，然后將上清在70℃水浴加熱15min，10000rpm4℃離心10min去沉淀，收集上清。收集的上清用于cota漆酶蛋白純化。

純化：由于重組表達(dá)的cota漆酶帶有多聚組氨酸標(biāo)簽(his6·tag)，因此使用鎳離子親和層析法分離目標(biāo)蛋白。鎳離子親和層析純化蛋白的步驟：(1)平衡：用10倍住體積的20mm緩沖液(含5mm的咪唑)平衡histraphp鎳離子柱(1ml)；(2)上樣：預(yù)先處理好的樣品以1mlmin^-1的流速上樣；(3)洗脫：用高濃度咪唑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫條件下峰型對(duì)應(yīng)的管號(hào)，并做酶活檢測(cè)，收集單峰對(duì)應(yīng)的有酶活的蛋白，跑sds-page蛋白電泳確認(rèn)單一條帶，獲得純化的酶。

實(shí)施例3b.pumilusw3漆酶的酶活測(cè)定和表達(dá)量分析

(1)酶活單位定義：采用abts方法測(cè)定漆酶酶活時(shí)，定義每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)活力單位。

(2)酶活測(cè)定步驟：1預(yù)熱：取2.4mlph4.0的檸檬酸緩沖液于試管中，在試管中加入0.5mlabts溶液(abts終濃度為0.5mm)置于50℃水浴鍋中預(yù)熱5min；2反應(yīng)：加入稀釋好的0.1ml樣品酶液，震蕩均勻。3測(cè)量：用分光光度計(jì)對(duì)震蕩均勻的樣品進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在420nm波長(zhǎng)下測(cè)量30s內(nèi)每分鐘od值的變化量(測(cè)量反應(yīng)顯示直線)并計(jì)算酶活力。

(3)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：以不同濃度的abts作為底物來(lái)測(cè)定純酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。反應(yīng)體系為3ml，abts的終濃度為10-1000μm。3ml的反應(yīng)體系包括2.4ml磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(100mm、ph3.6)、0.1ml純酶液、0.5mlabts溶液(分別配成終濃度10μm、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、1000μm)。將反應(yīng)體系置于50℃水浴鍋中預(yù)熱，然后加酶在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定30s內(nèi)od值的變化量(反應(yīng)速率為勻速反應(yīng))。根據(jù)酶活力公式計(jì)算酶活。

酶活力公式：

式中：△od-反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度值的差v總-反應(yīng)體系的體積(l)

n-酶液稀釋倍數(shù)△t-反應(yīng)時(shí)間(min)

vo-酶液的體積(l)m酶-酶蛋白的質(zhì)量(mg)

ε–底物摩爾消光系數(shù)，ε420＝3.6×10⁴l·mol^-1·cm^-1

以abts為底物測(cè)定了野生型、突變體wlf和突變體d501g/wlf漆酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)vmax、km、kcat、kcat/km、比活力，總活力以及蛋白含量。結(jié)果如下：

表1野生型(wt)和突變體漆酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和表達(dá)量

注：總活力(volμmetricactivity)濃縮了5倍。

從表1可以看出，突變體d501g/wlf的催化效率比wt要高，略低于wlf，但可溶性表達(dá)量d501g/wlf有明顯提高。

實(shí)施例4純化的b.pumilusw3重組漆酶和漆酶突變體最適作用ph和ph穩(wěn)定性分析

采用常規(guī)測(cè)定方法(均有文獻(xiàn)可參考)，使用abts作為底物，反應(yīng)溫度均為50℃。1個(gè)酶活單位定義為1分鐘內(nèi)氧化1μm底物所需的酶量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明重組漆酶和漆酶突變體都具有長(zhǎng)時(shí)間耐堿性環(huán)境佳的優(yōu)點(diǎn)，雖然突變體d501g/wlfph穩(wěn)定性較wt和wlf差一些，但依然很穩(wěn)定，相比較其他類(lèi)型的酶屬于穩(wěn)定性很強(qiáng)的酶(如圖4所示)。

實(shí)施例5純化的b.pumilusw3重組漆酶和漆酶突變體最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性分析

采用常規(guī)測(cè)定方法，使用abts作為底物，反應(yīng)ph3.6。1個(gè)酶活單位定義為1分鐘內(nèi)氧化1μm底物abts所需的酶量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明重組漆酶和漆酶突變體具有長(zhǎng)時(shí)間耐高溫環(huán)境佳的優(yōu)點(diǎn)(如圖5所示)。

實(shí)施例6純化的b.pumilusw3重組漆酶和漆酶突變體耐鹽性分析

首先將wt、wlf、d501g/wlf漆酶分別都保存于三種不同濃度的nacl溶液中(100mm、500mm、1m)，保存于4℃冰箱10h，然后在ph3.6、50℃條件下以abts為底物測(cè)酶活，反應(yīng)體系3ml，方法同實(shí)施例3中的酶活測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明重組漆酶和漆酶突變體在高鹽濃度下具有良好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例7b.pumilusw3重組漆酶和漆酶突變體在堿性條件下對(duì)偶氮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、三苯甲烷類(lèi)和芳香族雜環(huán)類(lèi)染料的脫色率測(cè)定

采用常規(guī)測(cè)定方法：反應(yīng)體系為5ml，染料0.25mg，純化后的漆酶10μg，介體為乙酰丁香酮，介體濃度1mm，反應(yīng)溫度為37℃，ph10，緩沖液為碳酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在堿性環(huán)境ph10，作用10h后，三種重組漆酶對(duì)1種偶氮類(lèi)染料acidred1的脫色率分別達(dá)到86.5％、93.3％和92.1％，對(duì)1種蒽醌類(lèi)染料acidblμe129的脫色率分別達(dá)到80.9％、85.4％和95.6％，同樣對(duì)三苯甲烷類(lèi)和芳香族雜環(huán)類(lèi)染料也具有良好脫色效果，對(duì)芳香族雜環(huán)類(lèi)染料的脫色率要低于其他幾種類(lèi)型染料(如圖7所示)。以上數(shù)據(jù)表明該重組漆酶在堿性環(huán)境下對(duì)偶氮類(lèi)染料和蒽醌類(lèi)染料以及三苯甲烷類(lèi)染料均具有很好的脫色效果，具有較大應(yīng)用潛力。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種可溶性表達(dá)量提高的短小芽胞桿菌cota漆酶突變體

<160>2

<210>seqidno.1

<211>1533bp

<212>dna

<213>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)，用于基因表達(dá)。

<400>seqidno.1

1atgaacctagaaaaatttgttgacgagctgccaattccagaagtcgcagagcccgtcaaa

61aaaaacccaagacaaacgtattatgaaatcgctatggaggaggtgttcctaaaagttcat

121agtgatctgcccccaaccaagttatggacctataatggcggtttgccttttccaaccatt

181aaagcgaatcgaaatgaaaaggtcaaagtgaaatggatgaacaaattgccgctgaaacac

241ttcctgcctgtcgatcataccattcacgctggacaccatgatgaacccgaagtcaaaaca

301gtcgttcacctgcatgggggcgtgacacctgcaagcagtgacggttatccagaggcttgg

361ttttcgcgagactttgaagcgaccggccccttctttgaacgagaggtttacgaataccct

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481aatgtatacgccggattagctggcttttatttgatctcagatgcgtttgaaaaatcactc

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