一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法，屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]凝結(jié)芽胞桿菌在菌劑加工過程中存在著菌體死亡率高的問題，而且加工的粉劑和液體制劑在儲存中存在芽胞存活率低的問題，影響產(chǎn)品的貨架壽命。在發(fā)酵工業(yè)中，為了延長微生物菌體的壽命，通常對菌體采用各種干燥措施。然而，微生物對干燥的溫度及脫水很敏感。所以，干燥過程中應(yīng)注意微生物存活率的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為了改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法，提高凝結(jié)芽胞桿菌的存活率，使凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑易于長期保存并且活力不降低，更加適用于工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法，其特征在于:將凝結(jié)芽胞桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵至對數(shù)期時(shí)添加糖和無機(jī)鹽，繼續(xù)至發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加多元醇和氨基酸，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥，得凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑。
[0005]優(yōu)選所述的凝結(jié)芽胞桿菌液體發(fā)酵對數(shù)期為發(fā)酵8—llh;發(fā)酵結(jié)束為發(fā)酵20—25h0
[0006]優(yōu)選所述的糖為葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環(huán)糊塘或葡聚糖中的一種或多種;糖的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為2.5—6.5g/L。
[0007]優(yōu)選所述的無機(jī)鹽為碳酸鈣、氯化鈉、氯化鎂、磷酸二氫鉀或氯化鈣中的一種或多種;無機(jī)鹽的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為0.01 —0.03g/L。
[0008]優(yōu)選所述的多元醇為聚乙二醇1000、聚乙二醇4000、甘油、山梨醇或肌醇中的一種或多種;多元醇的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為4.5-7.5g/L。
[0009]優(yōu)選所述的氨基酸為賴氨酸、精氨酸、聚天冬氨酸或聚-γ-谷氨酸中的一種或多種;氨基酸的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為2.5—5.5g/L。
[0010]優(yōu)選上述噴霧干燥參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為120-170°C ；出口溫度為60-80°C;噴口壓力為 100-140KPa。
[0011]其中凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵方法參照本實(shí)驗(yàn)室專利CN104738093A中的方法進(jìn)行發(fā)酵。包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng);其具體步驟如下:
[0012]A.菌種活化:將凝結(jié)芽胞桿菌CGMCC N0.6681菌株接到固體培養(yǎng)基平板中，設(shè)定溫度為34?38°C，培養(yǎng)時(shí)間為40?45h;
[0013]B.種子培養(yǎng):從步驟A培養(yǎng)好的平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中，34?38°C，140?180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12?20h得到種子培養(yǎng)液；
[0014]C.發(fā)酵培養(yǎng):是將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以140?180r/min，34?38°C條件下培養(yǎng)，得發(fā)酵液。
[0015]本發(fā)明即在上述步驟C中在34?38°C條件下，培養(yǎng)到對數(shù)期時(shí)添加糖和無機(jī)鹽，繼續(xù)至發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加多元醇和氨基酸，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥，得凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑。
[0016]上述凝結(jié)芽孢桿菌其分類命名為Bacilluscoagulans，參據(jù)的微生物(株)為:NJYHHWG 877005，該菌株是本課題組自主篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。其簡稱為CGMCC，保藏日期是2012年10月18日，登記入冊的編號是CGMCC N0.6681。
[0017]有益效果:
[0018]本發(fā)明得到的凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑，菌體存活率可達(dá)92%以上。本發(fā)明解決了常規(guī)方法生產(chǎn)凝結(jié)芽胞桿菌制劑活力低、常溫保存困難的問題，具有方法簡便、易操作，適合大批量生產(chǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合實(shí)例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定，下面實(shí)施中，如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0020]以下實(shí)施例所述的凝結(jié)芽胞桿菌菌株，菌種的拉丁學(xué)名是:Bacilluscoagulans，參據(jù)的菌株:NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC N0.6681 ο
[0021]實(shí)施例1
[0022]本實(shí)施例1凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵方法參照本實(shí)驗(yàn)室專利CN104738093A中實(shí)施例1的方法進(jìn)行發(fā)酵。
[0023]將凝結(jié)芽胞桿菌CGMCCN0.6681菌種接到固體培養(yǎng)基(蛋白胨10.00g/L，酵母膏
5.00g/L，氯化鈉5.00g/L，瓊脂粉18.00g/L，pH 7.0)平板中，設(shè)定溫度為34°C，培養(yǎng)時(shí)間為40ho
[0024]從培養(yǎng)好的平板中挑取一個(gè)單菌落，接入到種子培養(yǎng)基(葡萄糖50.00g/L，蛋白胨10.00g/L，酵母膏5.00g/L，pH 7.5(葡萄糖分消))中，三角瓶的種子培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為5%，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中，34°C，140r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12h。將種子培養(yǎng)液以2% (v/v)接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖22.00g/L、蛋白胨10.00g/L、酵母膏10.00g/L、MnS04.H20 0.0002g/L、CaC03 0.02g/L，pH 7.5(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為5 %，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以140r/min，34°C條件下培養(yǎng)；
[0025]將凝結(jié)芽胞桿菌經(jīng)液體發(fā)酵8h并使其處于芽胞形成期，往培養(yǎng)液中添加經(jīng)滅菌后的2.5g/L葡聚糖和0.01g/L的碳酸|丐;繼續(xù)發(fā)酵至20h后添加聚乙二醇40004.5g/L和賴氨酸
4.5g/L，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥過程要求進(jìn)風(fēng)口溫度為120°C，出口溫度為60°C，噴口壓力為lOOKPa。所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算存活率。菌體存活率達(dá)93.6%，與凝結(jié)芽胞桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比，存活率提高20.3%。
[0026]實(shí)施例2
[0027]本實(shí)施例凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵方法參照本實(shí)驗(yàn)室專利CN104738093A中實(shí)施例2的方法進(jìn)行發(fā)酵。
[0028]將凝結(jié)芽胞桿菌CGMCCN0.6681菌種接到固體培養(yǎng)基(蛋白胨15.00g/L，酵母膏
6.00g/L，氯化鈉6.00g/L，瓊脂粉19.00g/L，pH 7.1)平板中，設(shè)定溫度為36°C，培養(yǎng)時(shí)間為43h0
[0029]從培養(yǎng)好的平板中挑取一個(gè)單菌落，接入到種子培養(yǎng)基(葡萄糖55.00g/L，蛋白胨12.00g/L，酵母膏6.00g/L，pH 7.8(葡萄糖分消))中，三角瓶種子培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為12%，在迴轉(zhuǎn)式丨旦溫調(diào)速搖瓶柜中，36°C，150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)18h。將種子培養(yǎng)液以4% (v/v)接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖24.00g/L、蛋白胨11.00g/L、酵母膏12.00g/L、MnS04.H20 0.00025g/L、CaC03 0.04g/L，pH 7.8(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為12%，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以150r/min，36°C條件下培養(yǎng)；
[0030]經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)9h并使其處于芽胞形成期，往培養(yǎng)液中添加經(jīng)滅菌后的4.5g/L海藻糖和0.02g//L的氯化鈣;繼續(xù)發(fā)酵至22h后添加聚乙二醇10005.5g/L和精氨酸5.0g/L，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥過程要求進(jìn)風(fēng)口溫度為170°C，出口溫度為80°C，噴口壓力為140KPa。所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算存活率。菌體存活率達(dá)92.9%。與凝結(jié)芽胞桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比，存活率提高22.7%。
[0031]實(shí)施例3
[0032]本實(shí)施例凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵方法參照本實(shí)驗(yàn)室專利CN104738093A中實(shí)施例3的方法進(jìn)行發(fā)酵。
[0033]將凝結(jié)芽胞桿菌CGMCCN0.6681菌種接到固體培養(yǎng)基(蛋白胨15.00g/L，酵母膏8.00g/L，氯化鈉8.00g/L，瓊脂粉20.00g/L，pH 7.2)平板中，設(shè)定溫度為38°C，培養(yǎng)時(shí)間為45h。
[0034]從培養(yǎng)好的平板中挑取一個(gè)單菌落，接入到種子培養(yǎng)基(葡萄糖60.00g/L，蛋白胨15.00g/L，酵母膏8.00g/L，pH 8.0(葡萄糖分消))中，三角瓶種子培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為15%，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中，38°C，180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20h。將種子培養(yǎng)液以7%(￥八)接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖25.0(^/1、蛋白胨12.0(^/1、酵母膏15.0(^/1、MnS04.H20 0.0003g/L、CaC03 0.05g/L，pH 8.0(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量(v/v)為15%，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以180r/min，38°C條件下培養(yǎng)；
[0035]將凝結(jié)芽胞桿菌經(jīng)液體發(fā)酵llh并使其處于芽胞形成期，往培養(yǎng)液中添加經(jīng)滅菌后的6.5g/L環(huán)湖塘和0.03g/L的氯化鎂；繼續(xù)發(fā)酵至24h后添加山梨醇7.5g/L和賴氨酸
2.5g/L，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥過程要求進(jìn)風(fēng)口溫度為150°C，出口溫度為70°C，噴口壓力為130KPa。所得制劑經(jīng)稀釋平板計(jì)數(shù)后計(jì)算存活率。菌體存活率達(dá)92.3%。與凝結(jié)芽胞桿菌經(jīng)常規(guī)液體發(fā)酵后直接進(jìn)行噴霧干燥相比，存活率提高19.5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法，其特征在于將凝結(jié)芽胞桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵至對數(shù)期時(shí)添加糖和無機(jī)鹽，繼續(xù)至發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加多元醇和氨基酸，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的凝結(jié)芽胞桿菌液體發(fā)酵對數(shù)期為發(fā)酵8—1 lh;發(fā)酵結(jié)束為發(fā)酵20—25h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的糖為葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環(huán)糊塘或葡聚糖中的一種或多種;糖的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為 2.5—6.5g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的無機(jī)鹽為碳酸鈣、氯化鈉、氯化鎂、磷酸二氫鉀或氯化鈣中的一種或多種;無機(jī)鹽的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為 0.01 —0.03g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的多元醇為聚乙二醇1000、聚乙二醇4000、甘油、山梨醇或肌醇中的一種或多種;多元醇的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為4.5—7.5g/L。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的氨基酸為賴氨酸、精氨酸、聚天冬氨酸或聚-T -谷氨酸中的一種或多種;氨基酸的添加質(zhì)量與凝結(jié)芽胞桿菌發(fā)酵液的體積比為 2.5—5.5g/L。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述噴霧干燥參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)口溫度為120-170°C;出口溫度為60-80°C;噴口壓力為 100-140KPa。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高活性凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑的制備方法，屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將凝結(jié)芽胞桿菌液體發(fā)酵至對數(shù)期添加2.5—6.5g/L的糖和0.01—0.03g/L的無機(jī)鹽，發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加4.5—7.5g/L的多元醇和2.5—5.5g/L的氨基酸，攪拌均勻后，進(jìn)行噴霧干燥。得凝結(jié)芽胞桿菌活菌制劑，菌體存活率可達(dá)92％以上。本發(fā)明解決了常規(guī)方法生產(chǎn)凝結(jié)芽胞桿菌制劑活力低、常溫保存困難的問題，具有方法簡便、易操作，適合大批量生產(chǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。CGMCC No.668120121018
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/07
【公開號】CN105441354
【申請?zhí)枴緾N201510710874
【發(fā)明人】胡永紅, 程麗民, 曹翠翠, 楊文革, 馬小平, 丁志雯, 王春曉, 吳剛, 章泳, 錢永根
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年10月28日